Come ricordi interferire dipende da quando il nuovo apprendimento si verifica
Per testare l’ipotesi che i tempi della seconda formazione è un fattore chiave nel determinare se attivo o retroattiva interferenza si verifica, abbiamo impiegato un paradigma che è stato progettato per studiare la concorrenza tra due diversi spunti che sono allenati a parte, ma avere un risultato comune, e.,g., lo stesso tipo di risposta condizionata23. Nello specifico, abbiamo eseguito una doppia procedura di condizionamento classico appetitivo che coinvolge due stimoli chimici neutri, gamma – nonalattone o amil acetato (gli stimoli condizionati), entrambi abbinati a uno stimolo alimentare saliente (saccarosio, lo stimolo incondizionato) che attiva il circuito di alimentazione ben identificato di Lymnaea11,24,25., Un singolo accoppiamento di uno stimolo condizionato con lo stimolo incondizionato porta alla formazione di memoria appetitiva a lungo termine, in particolare, con periodi non-lapse e lapse osservati negli stessi punti di tempo durante il consolidamento della memoria8,19 (Fig. 1). L’addestramento consecutivo con questi due paradigmi appetitivi è stato impiegato per stabilire il tipo di interferenza che si verifica durante un periodo non-lapse rispetto a un periodo di intervallo della stessa sequenza di consolidamento.,
Gli animali sono stati addestrati con gamma-nonalattone + saccarosio (indicato come “primo allenamento appetitivo”), e poi un secondo allenamento di amil acetato + saccarosio (indicato come “secondo allenamento appetitivo”) è stato applicato a un punto non-lapse (1 h) o lapse (2 h) della prima memoria. Sono stati quindi testati per la presenza di memoria a lungo termine 24 h dopo il primo allenamento (Fig. 1 bis)., Gli animali che hanno ricevuto il secondo addestramento appetitivo al punto non-lapse hanno mantenuto una memoria per il primo stimolo condizionato (gamma-nonalattone) ma non per il secondo stimolo condizionato (acetato di amile) (Fig. 1b, ‘non-lapse’), indicativo di interferenza proattiva, mentre gli animali che hanno ricevuto il secondo allenamento appetitivo durante il punto di lapse avevano una memoria per il secondo stimolo condizionato, ma non per il primo stimolo condizionato (Fig. 1b,”intervallo”), indicativo di interferenza retroattiva (animali testati con gamma-nonalattone: ANOVA a senso unico, p < 0.,001 (F(3,132) = 17.27), Bonferroni test: 1 h vs naïve p < 0.001, first training alone vs naïve p < 0.001, 2 h vs naïve p > 0.05. Amyl acetate tested animals: One-way ANOVA, p < 0.001 (F(3,123) = 9.72), Bonferroni test: 2 h vs naïve p < 0.001, second training alone vs naïve p < 0.001, 1 h vs naïve p > 0.05).
Interferenza proattiva e retroattiva e consolidamento parallelo di memorie associative dopo condizionamento a prova singola. una linea temporale semplificata del paradigma del doppio condizionamento appetitivo. b Gli animali hanno mostrato una risposta maggiore al primo stimolo condizionato (CS), il gamma-nonalattone (GNL), dopo il primo allenamento da solo (n = 40) o quando il secondo allenamento si è verificato durante il non-lapse (1 h: n = 32) ma non il lapse (2 h: n = 29) rispetto ai controlli naïve (n = 35)., Le risposte al secondo stimolo condizionato, l’amil acetato (AA), sono state maggiori negli animali che hanno ricevuto un secondo addestramento da solo (n = 24) o un secondo addestramento durante l’intervallo (2 h: n = 31) ma non il non intervallo (1 h: n = 32) rispetto ai controlli naïve (n = 40). I grafici di violino mostrano la densità dei dati che si estende da valori minimi a massimi. Boxplots interni mostrano mediana e interquartile gamma (primo e terzo quartile). I baffi rappresentano valori da minimo a massimo. I cerchi mostrano la media. c Linea temporale semplificata di appetitivo seguita da allenamento avversivo., d Gli animali hanno mostrato una maggiore risposta allo stimolo condizionato appetitivo (gamma-nonalattone) dopo il solo allenamento appetitivo (n = 30) o quando si è verificato un allenamento avversivo durante il non-lapse (1 h: n = 29) ma non il lapse (2 h: n = 30) rispetto ai controlli naïve (n = 28). Le risposte allo stimolo condizionato avversivo, L-serina (L-s), sono state inferiori negli animali che hanno ricevuto un allenamento avversivo durante l’intervallo (2 h: n = 29), non-lapse (n = 30) e dopo l’allenamento avversivo da solo (n = 30) rispetto ai controlli naïve (n = 29). e Linea temporale semplificata di avversione seguita da allenamento appetitivo., gli animali f hanno mostrato una risposta inferiore allo stimolo condizionato avversivo dopo l’allenamento avversivo da solo (n = 20) o quando l’allenamento appetitivo si è verificato durante il non-lapse (1 h: n = 20) ma non il lapse (2 h: n = 20) rispetto ai controlli naïve (n = 20)., Risposte ai appetitiva stimolo condizionato è stato maggiore negli animali che hanno ricevuto appetitiva formazione durante l’intervallo (2 h: n = 20), camere non-lapse (n = 16) e dopo appetitiva la formazione da sola (n = 20) confrontato con ingenuo controlli (n = 20)
e ‘ possibile che la mancanza di memoria dopo l’interferenza è dovuta per l’animale incapacità contemporaneamente memorizzare due a lungo termine simili ricordi., Per esaminare questo, abbiamo addestrato animali con entrambi i tipi di paradigmi appetitivi ma distanziati di 24 ore, consentendo alla prima memoria di consolidarsi completamente prima del secondo allenamento (Fig. 2 bis). Ogni animale è stato testato per la sua risposta a entrambi gli stimoli condizionati 24 h dopo il secondo allenamento. Per garantire che l’ordine dei test non influenzasse la risposta dell’animale, un gruppo è stato testato prima per la loro risposta al gamma-nonalattone e poi all’amil acetato 1 h più tardi, mentre un secondo gruppo li ha ricevuti nell’ordine inverso., Entrambi i gruppi hanno mostrato una maggiore risposta a entrambi gli stimoli condizionati rispetto agli animali naïve che indicano la presenza di due ricordi nello stesso animale (Fig. 2 ter).
Un’ipotesi alternativa è che l’incapacità di consolidare entrambe le memorie contemporaneamente sia dovuta alla competizione tra due memorie simili che utilizzano lo stesso circuito neurale sottostante. Abbiamo studiato se le stesse regole di interferenza si applicassero quando il secondo allenamento impiegava un paradigma che utilizza un circuito diverso da quello attivato dal primo apprendimento., Il condizionamento avversivo dell’alimentazione in Lymnaea viene elaborato da un circuito neuronale non coinvolto nel condizionamento della ricompensa alimentare26; pertanto è stato utilizzato un paradigma avversivo per testare l’ipotesi della competizione. Un singolo accoppiamento di L-serina (uno stimolo appetitivo, vedi Fig. 1d) con chinino (uno stimolo avversivo che inibisce l’alimentazione27) indotta memoria a lungo termine, espressa come risposta di alimentazione diminuita allo stimolo condizionato, quando testato a 24 h rispetto ai controlli naïve (punteggio di differenza di alimentazione naïve: 21.1 ± 2.5, n = 16, L-serina + chinino punteggio di differenza di alimentazione: 9.8 ± 2.,1, n = 17, prova t spaiata, p = 0,0016, t = 3,47, df = 31). In particolare, durante il consolidamento della memoria avversiva, i vuoti si sono verificati negli stessi punti temporali della formazione della memoria appetitiva, dimostrando che i vuoti sono una caratteristica generale durante il consolidamento in Lymnaea (Fig. 3). Successivamente, gli animali sono stati addestrati con gamma-nonalattone + saccarosio (allenamento appetitivo), seguito da un allenamento avversivo negli stessi punti non-lapse o lapse della prima memoria come nel paradigma dual appetitive (Fig. 1c)., L’allenamento avversivo durante il punto di non-lapse ha dato origine a una memoria sia appetitiva che avversiva (Fig. 1d, ‘non-lapse’), che indica l’assenza di interferenza proattiva, mentre il condizionamento avversivo durante l’intervallo di memoria appetitivo ha portato a una memoria avversiva, ma non a una memoria appetitiva (Fig. 1d, ‘decadenza’) (gamma-nonalactone testato animali: One-way ANOVA, p < 0.001 (F(A 3.113) = 9.47), test Bonferroni: 1 h vs ingenuo p < 0.001, appetitiva da solo vs ingenuo p < 0.001, 2 h vs ingenuo p > 0.05., L-serina testato animali: One-way ANOVA, p < 0.001 (F(3,114) = 12.13), test Bonferroni: aversive da solo vs ingenuo p < 0.001, 1 h vs ingenuo p < 0.001, 2 h vs ingenuo p < 0.01).
Per verificare se la mancanza di interferenza proattiva tra la memoria appetitiva e quella avversiva fosse dovuta al fatto che quest’ultima era più forte della prima, e quindi meno incline alle interferenze, abbiamo invertito l’ordine dell’allenamento, eseguendo l’allenamento avversivo seguito dall’allenamento appetitivo (Fig. 1e)., Con questo invertito paradigma, abbiamo osservato lo stesso modello di memoria interferenza quando il appetitiva formazione preceduto il repellente e della formazione (L-serina testato animali: One-way ANOVA, p < 0.001 (F(3,76) = 7.34), test Bonferroni: 1 h vs ingenuo p < 0.001, aversive da solo vs ingenuo p < 0.01, 2 h vs ingenuo p > 0.05. Animali testati con gamma-nonalattone: ANOVA a senso unico, p< 0.001 (F(3,72) = 10.18), Test Bonferroni: appetitive alone vs naïve p< 0.,001, 1 h vs naïve p < 0.01, 2 h vs naïve p < 0.001) (Fig. 1f). Presi insieme, questi risultati dimostrano che l’induzione di una nuova memoria associativa durante l’intervallo della prima memoria provoca interferenze retroattive indipendentemente dal fatto che il secondo paradigma di allenamento sia appetitivo o avversivo. Tuttavia, durante il periodo non-lapse l’interferenza proattiva si verifica solo quando il secondo paradigma di allenamento è simile al primo. Con un paradigma dissimile, si verifica il consolidamento della doppia memoria., Successivamente abbiamo cercato di identificare possibili meccanismi neurali alla base di queste differenze nell’espressione comportamentale dell’uno o dell’altro tipo di memoria a seconda dei paradigmi utilizzati.
Il modo in cui due memorie interferiscono dipende dai circuiti che usano
Abbiamo ipotizzato che l’incapacità di consolidare simultaneamente due memorie appetitive sia dovuta al fatto che entrambe sono codificate all’interno dello stesso circuito di memoria, mentre l’uso dell’associazione avversiva di un meccanismo di circuito distinto consente il doppio consolidamento al di fuori dei periodi di, Un cambiamento cellulare precedentemente identificato coinvolto nella memoria a lungo termine dopo condizionamento appetitivo in Lymnaea è la depolarizzazione persistente di un neurone modulatorio nella rete di alimentazione, il CGCS (cellule giganti cerebrali)9,28,29. Le porte di depolarizzazione indotte dall’apprendimento-nell’input di stimolo condizionato all’alimentazione di interneuroni simili a comandi, che in animali addestrati si traduce nell’attivazione della rete di alimentazione9. Qui, dimostriamo che entrambi i tipi di allenamento appetitivo inducono la stessa depolarizzazione persistente rispetto ai controlli naïve (ANOVA unidirezionale, p < 0.,001(F (2,35) = 26.3), Test Bonferroni: primo allenamento da solo vs naïve p < 0.001, secondo allenamento da solo vs naïve p < 0.001, primo allenamento da solo vs secondo allenamento da solo p > 0.05) (Fig. 2 bis-c). Successivamente abbiamo testato se il condizionamento avversivo ha influenzato i CGC e non ha riscontrato cambiamenti significativi nel loro potenziale di membrana rispetto ai controlli naïve (test t spaiato, p = 0,53, t = 0,63, df = 22) (Fig. 2d-f)., Non c’è stato alcun cambiamento nella resistenza della membrana CGC o nelle caratteristiche del picco dopo condizionamento appetitivo o avversivo (resistenza della membrana CGC: allenamento appetitivo, ANOVA a senso unico, p = 0.17 (F(2,34) = 1.77). Allenamento avversivo, test t spaiato, p = 0,67, t = 0,44, df = 22.) (Fico. 2c, f; Fig.supplementare. 4 bis, lettera b). Pertanto, entrambi i paradigmi appetitivi inducono lo stesso cambiamento cellulare, mentre l’allenamento avversivo non influisce sulle proprietà di questo neurone suggerendo che la memoria è codificata in un altro circuito.
Diversi substrati neuronali per l’apprendimento appetitivo contro avversivo. a tracce rappresentative dell’attività CGC 24 h dopo che gli animali hanno ricevuto il primo o il secondo addestramento appetitivo da soli e da animali naïve. b I CGC di entrambi i gruppi di allenamento appetitivo primo (n = 12) e secondo (n = 13) sono stati depolarizzati rispetto ai controlli naïve (n = 13) ma non confrontati tra loro. I grafici di violino mostrano la densità dei dati che si estende da valori minimi a massimi. Boxplots interni mostrano mediana e interquartile gamma (primo e terzo quartile)., I baffi rappresentano valori da minimo a massimo. I cerchi mostrano la media. la resistenza della membrana c CGC non era diversa tra le condizioni. d Tracce rappresentative dell’attività di CGC da animali aversively condizionati e naïve. e Non vi era alcuna differenza significativa nel potenziale di membrana tra le due condizioni (n = 12 per entrambe). f La resistenza della membrana non era significativamente diversa tra le condizioni. g Trame di calore di attività PlB normalizzata in risposta a stimoli condizionati avversivi (CS) in preparazioni da animali aversively addestrati e ingenui., Dati organizzati da attività PlB alta a bassa dopo lo stimolo condizionato. La linea bianca rappresenta l’inizio dello stimolo condizionato. h Tracce rappresentative e trama di linea normalizzata della frequenza di picco del PlB in risposta allo stimolo condizionato avversivo. Linea e ombreggiatura mostrano media ± errore standard della media, rispettivamente. riscaldo trame di attività PLB normalizzata in risposta a stimoli condizionati appetitivi in preparazioni di animali addestrati e naïve appetitivi. j Tracce rappresentative e trama di linea normalizzata della frequenza di picco del PlB in risposta allo stimolo condizionato appetitivo., Abbreviazioni: appet, appetitive; avers, adversive; tr, training; MP, membrane potential; norm, normalized; prep, preparation
Abbiamo quindi cercato di identificare i cambiamenti indotti dal condizionamento avversivo. Poiché la risposta condizionata era una riduzione dell’alimentazione, abbiamo ragionato che potrebbe essere dovuta a un maggiore effetto inibitorio proveniente dal circuito di ritiro difensivo., Un neurone candidato per questo è il PLB interneuron30 che collega i circuiti di ritiro e alimentazione e la sua attivazione da stimoli avversivi è sufficiente per inibire l’alimentazione31. In preparazioni cerebrali isolate da animali aversivamente condizionati, un analogo in vitro dello stimolo condizionato (vedi Metodi) ha causato un aumento significativo della frequenza di cottura del PlB rispetto ai controlli naïve (test di Mann Whitney, p = 0,029, U = 106) (Fig. 2g, h), nonché una minore espressione di cicli di alimentazione fittizi (un correlato in vitro della risposta condizionata) (Fig. 4 quater, d)., I tassi di attivazione del PlB prima dello stimolo condizionato non erano significativamente diversi tra le condizioni (test t spaiato, p = 0,94, t = 0,08, df = 36). Le risposte CGC allo stimolo condizionato non hanno mostrato alcun cambiamento dopo il condizionamento avversivo (Fig. 4 e). Abbiamo testato se l’attività del PlB fosse alterata dopo il condizionamento appetitivo, ma non abbiamo trovato alcun cambiamento nei tassi di cottura del PlB in risposta allo stimolo condizionato appetitivo (test di Mann Whitney, p = 0,39, U = 56,5) o nei suoi tassi di cottura prima dello stimolo condizionato (test t spaiato, p = 0,38, t = 0,89, df = 22) (Fig. 2i, j)., Tuttavia, i preparati derivati da animali condizionati appetitosamente hanno mostrato ancora una maggiore risposta alimentare fittizia al gamma-nonalattone rispetto ai controlli naïve (Fig. 4f, g). Questi risultati dimostrano che l’apprendimento avversivo provoca un aumento di un percorso inibitorio, distinto dai cambiamenti neurali alla base dei ricordi appetitivi. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che la competizione all’interno dello stesso circuito di memoria è un fattore limitante nella capacità degli animali di consolidare più ricordi simili., Tale competizione non influisce sul consolidamento di memorie dissimili che si basano su diversi meccanismi circuitali, tenendo conto della mancanza di interferenza proattiva delle memorie appetitive e avversive nel punto non-lapse.
L’interferenza retroattiva richiede un nuovo apprendimento in generale
Abbiamo quindi cercato di sezionare quale aspetto del secondo allenamento fosse responsabile dell’interferenza retroattiva nei punti di intervallo., Abbiamo testato se l’induzione di una seconda memoria associativa fosse necessaria per bloccare la prima memoria o se semplicemente la presentazione degli stimoli condizionati e incondizionati durante il secondo allenamento fosse sufficiente per agire come un distruttore della memoria. Per testare questo, abbiamo eseguito la presentazione all’indietro dello stimolo incondizionato + stimolo condizionato ( indicato come BW) (Fig. 3a), che non ha portato alla memoria a lungo termine utilizzando i protocolli appetitive (Mann Whitney test, p = 0.07, U = 172.5) o avversive (Mann Whitney test, p = 0.67, U = 174.5) (Fig., 3b, c), confermando che i paradigmi BW non inducono la memoria associativa. A quel punto, abbiamo eseguito uno appetitiva o aversive BW condizionata in un lasso punto della prima memoria e ha scoperto che nessuno dei due ha avuto un effetto sull’espressione della prima memoria (appetitiva BW: test di Kruskal–Wallis, p = 0.0043, H = 10.88; Dunn test, BW a 2 h vs ingenuo p < 0.05 e primo allenamento da solo vs ingenuo p < 0.01. BW avversivo: Test di Kruskal–Wallis, p = 0.001, H = 13.81; Test di Dunn, BW a 2 h vs naïve p < 0.,05, primo allenamento da solo vs naïve p < 0.001) (Fig. 3d-g). Questi risultati suggeriscono che l’induzione di una seconda memoria associativa è necessaria per l’interferenza retroattiva con la prima memoria.
L’acquisizione di nuova memoria è necessaria per interferenze retroattive. una linea temporale del paradigma del condizionamento all’indietro (BW)., b BW presentazione di saccarosio e acetato di amile (AA) non suscita una risposta significativamente maggiore allo stimolo condizionato (CS) rispetto ai controlli naïve quando testato a 24 h (BW: n = 24, naïve: n = 21). I grafici di violino mostrano la densità dei dati che si estende da valori minimi a massimi. Boxplots interni mostrano mediana e interquartile gamma (primo e terzo quartile). I baffi rappresentano valori da minimo a massimo. I cerchi mostrano la media. c BW presentazione di chinino e L-serina (L-s) non induce una memoria avversiva (BW: n = 19, naïve: n = 20)., d Linea temporale di BW con saccarosio e acetato di amile durante l’intervallo della prima memoria appetitiva (gamma-nonalattone (GNL) accoppiato con saccarosio). e BW durante l’intervallo non ha influenzato la memoria a lungo termine rispetto ai controlli naïve (2 h: n = 22, primo allenamento da solo: n = 21, naïve: n = 24). f Time-line di BW con chinino e L-serina durante l’intervallo della prima memoria appetitiva (gamma-nonalattone accoppiato con saccarosio)., g BW durante l’intervallo non ha influenzato la memoria a lungo termine rispetto ai controlli naïve (2 h: n = 20, solo primo allenamento: n = 20, naïve: n = 20)
Ciò ha sollevato la questione se sia specificamente nuovo apprendimento associativo o nuovo apprendimento in generale che possa causare interferenze retroattive. Per affrontare questo problema abbiamo usato un paradigma non associativo come seconda formazione. Abbiamo dimostrato che una forte stimolazione tattile della testa porta a una risposta di ritiro sensibilizzata a un breve stimolo “light off” (Fig. 4 bis)., Questo breve stimolo non ha innescato una risposta di ritiro in animali naïve (Misure ripetute ANOVA, p = 0.62(F (3,42) = 16.58)) (Fig. 4 bis). Al contrario, gli animali che sono stati esposti a forte stimolazione tattile 10 min prima della ‘luce’ di stimolo ha mostrato un significativo ritiro di risposta (per misure Ripetute ANOVA, p < 0.001 (F(3,42) = 0.54), Dunnett test: prima di vs 5 s p < 0.001, prima di vs 10 s p < 0.001, prima di vs 20 s p > 0.05) (Fig. 4 bis)., Pertanto, una forte stimolazione tattile della testa provoca sensibilizzazione, una forma di apprendimento non associativo.
Il nuovo apprendimento non associativo è sufficiente per interferenze retroattive. una stimolazione tattile della testa induce sensibilizzazione a breve termine. 10 min dopo la stimolazione tattile, è stato presentato all’animale un breve stimolo luminoso (immagine inserita) e misurata la loro risposta di ritiro., Gli animali hanno mostrato un aumento significativo della risposta di ritiro allo stimolo light off, che è durato per 10 s dopo lo stimolo (immagine a sinistra, prima dello stimolo; immagine a destra, dopo lo stimolo) (n = 15). Gli animali naïve non hanno mostrato una risposta significativa al ritiro allo stesso stimolo (n = 15). I dati mostrano media ± errore standard della media. b Linea temporale di applicazione della stimolazione sensibilizzante dopo condizionamento appetitivo., la sensibilizzazione c durante l’intervallo, ma non durante il non-intervallo, interrompe significativamente la memoria dell’animale per lo stimolo condizionato (CS), gamma-nonalattone (GNL), quando testato a 24 h (primo allenamento da solo: n = 29, 2 h: n = 19, 1 h: n = 22, naïve: n = 29). I grafici di violino mostrano la densità dei dati che si estende da valori minimi a massimi. Boxplots interni mostrano mediana e interquartile gamma (primo e terzo quartile). I baffi rappresentano valori da minimo a massimo., I cerchi mostrano la media
Successivamente, abbiamo applicato la stimolazione sensibilizzante al punto di intervallo della memoria appetitiva (Fig. 4 ter). Abbiamo dimostrato che retroattivamente interferito con la memoria associativa, mentre quando applicate al non-lapse punto, la memoria era integro (One-way ANOVA, p < 0.001 (F(3,78) = 7.191), test Bonferroni: primo allenamento da solo vs ingenuo p < 0.001, 1 h vs ingenuo p < 0.01, 2 h vs ingenuo p > 0.05) (Fig. 4 quater)., Pertanto, l’acquisizione di una memoria associativa o non associativa durante il periodo di intervallo interferisce retroattivamente con la memoria associativa originale.
L’interferenza retroattiva interrompe il consolidamento della memoria
Successivamente abbiamo testato se l’apparente sostituzione della prima memoria con la seconda era dovuta all’interferenza retroattiva che interrompeva il consolidamento della memoria originale o alla soppressione della sua espressione da parte della seconda memoria. Se la prima memoria non può essere recuperata bloccando la seconda, ciò indicherebbe che il suo consolidamento è stato interrotto., Tuttavia, se potesse essere recuperato, ciò indicherebbe che l’espressione della prima traccia di memoria viene attivamente soppressa dalla seconda memoria coesistente. Per testare questo, il secondo allenamento appetitivo è stato eseguito 2 h dopo il primo allenamento appetitivo per interferire con la prima memoria. La stimolazione sensibilizzante è stata quindi applicata 2 h più tardi, in un intervallo nel consolidamento del secondo apprendimento (Fig. 5a) per bloccare la seconda memoria (Fig. 5 ter)., Ciò assicurava che la stimolazione sensibilizzante avvenisse in un punto di intervallo della seconda memoria (2 h) ma in un punto di non intervallo della prima memoria (4 h) (Fig. 5a, b mostra che la stimolazione sensibilizzante è sufficiente a bloccare la seconda memoria appetitiva). L’applicazione della stimolazione sensibilizzante da sola 4 h dopo il primo allenamento appetitivo non ha alcun effetto sulla prima memoria (Fig. 5 quater, d). Sebbene questo paradigma sia riuscito a bloccare la seconda memoria, l’espressione della prima memoria non è stata ripristinata a 24 h (Fig. 5b, gamma-nonalattone)., Al contrario, quando non sensibilizzante stimolazione è stata applicata, c’è stata la prevista interruzione della prima memoria e l’acquisizione della seconda (acetato di amile testato animali: One-way ANOVA, p < 0.001 (F(2,73) = 21.11), test Bonferroni: no sensibilizzazione vs ingenuo p < 0.001, n sensibilizzazione vs sensibilizzazione p < 0.001, sensibilizzazione vs ingenuo p > 0.05. Animali testati con gamma-nonalattone: ANOVA unidirezionale, p = 0,33 (F(2,64) = 1,12)) (Fig. 5 ter).
Il blocco della seconda memoria non comporta il ripristino della prima memoria. una linea temporale di esperimenti. Gli animali hanno ricevuto il primo addestramento seguito dal secondo addestramento durante l’intervallo di 2 ore. La stimolazione sensibilizzante è stata applicata 2 h dopo il secondo allenamento (4 h dopo il primo allenamento). Gli animali sono stati quindi testati per la loro risposta allo stimolo condizionato (CS), al gamma-nonalattone (GNL) o all’acetato di amile (AA), a 24 ore., b La sensibilizzazione è stata sufficiente a bloccare la seconda memoria, mentre nessuno stimolo sensibilizzante ha prodotto una forte seconda memoria rispetto ai controlli naïve (sensibilizzazione: n = 22, nessuna sensibilizzazione dopo il secondo allenamento: n = 24, naïve: n = 30). Non c’è stata risposta aumentata a gamma-nonalattone oltre i livelli naïve a 24 h nonostante il blocco della seconda memoria., Anche gli animali che hanno ricevuto il secondo allenamento senza sensibilizzazione non hanno avuto una risposta significativamente diversa al gamma-nonalattone rispetto ai controlli naïve (sensibilizzazione: n = 22, nessuna sensibilizzazione dopo il secondo allenamento: n = 18, naïve: n = 27). I grafici di violino mostrano la densità dei dati che si estende da valori minimi a massimi. Boxplots interni mostrano mediana e interquartile gamma (primo e terzo quartile). I baffi rappresentano valori da minimo a massimo. I cerchi mostrano la media. c Linea temporale di iniezione di anisomicina (ANI) dopo il secondo allenamento appetitivo., d ANI ha bloccato il consolidamento della seconda memoria, mentre l’iniezione salina ha prodotto una forte seconda memoria (ANI: n = 20, salina: n = 20, naïve: n = 22). ANI dopo il secondo allenamento non è possibile recuperare la memoria, testato nelle 24 h (ANI: n = 20, saline: n = 20, ingenuo: n = 20)
L’uso di sensibilizzazione protocollo ci ha permesso di concludere che, quando la seconda memoria è stato bloccato al suo 2 h lapse punto, la prima memoria non riemergere., Tuttavia, poiché il blocco della seconda memoria con sensibilizzazione poteva essere eseguito con successo solo al memory lapse 2 h dopo il secondo allenamento e sapevamo solo che cancellava la seconda memoria quando testato a 24 h, avevamo bisogno di un altro metodo che bloccasse rapidamente la formazione della memoria e portasse alla cancellazione della seconda memoria in una fase iniziale. Tale metodo stabilirebbe se il blocco solo dei primi processi di consolidamento della seconda memoria avrebbe salvato la prima memoria., Abbiamo quindi utilizzato metodi farmacologici per bloccare il consolidamento precoce della seconda memoria. Il trattamento con l’inibitore traslazionale anisomicina (ANI) blocca rapidamente la sintesi di nuove proteine nel cervello di Lymnae32 e la sua applicazione post-allenamento impedisce l’espressione della memoria già da 1 h dopo la condizionazione19 così come il suo ulteriore consolidamento nella memoria a lungo termine32. Gli animali sono stati iniettati con ANI o soluzione salina 10 min dopo il secondo allenamento appetitivo (2 h 10 min dopo il primo allenamento appetitivo) e testati per la memoria a lungo termine (Fig. 5 quater)., L’iniezione ANI da sola a 2 h 10 min non ha avuto alcun effetto sull’espressione della prima memoria (Fig. 5e, f) ma aveva bloccato con successo la seconda memoria (Fig. 5d). Tuttavia, questo intervento precoce non è riuscito a salvare la prima memoria (Fig. 5d), indicando che è stato effettivamente interrotto dalla seconda memoria entro un’ora dopo il secondo allenamento. Gli animali iniettati con soluzione salina hanno mostrato l’interruzione della memoria prevista (animali testati con acetato di amile: ANOVA a senso unico, p< 0.001 (F(2,59) = 11.09), test Bonferroni: saline vs naïve p< 0.,001, ANI vs saline p <0.01, ANI vs naïve p> 0.05. Animali testati con gamma-nonalattone: ANOVA unidirezionale, p = 0,75(F (2,57) = 0,295)) (Fig. 5d). Questi esperimenti suggeriscono che l’interferenza retroattiva avviene entro una finestra temporale iniziale dopo l’acquisizione della seconda memoria. Concludiamo che il blocco della seconda memoria non porta all’espressione di una prima traccia di memoria “soppressa”. Questi esperimenti supportano quindi la conclusione che, almeno a livello comportamentale, la seconda memoria sostituisce efficacemente la prima memoria.