Introduzione
i Microbi sono troppo piccoli per essere visti ad occhio nudo; sono in grado di sopravvivere in condizioni che la maggior parte potrebbe pensare che sono invivibili come l’ambiente anaerobico nel rumine delle mucche, sorgenti calde e fredde acque dell’Antartico (Quali sono i microbi, 2010). Milioni di microbi vivono sia sul corpo umano che nel corpo umano e possono entrambi aiutarci a sopravvivere o farci ammalare, meno dell ‘ 1% dei batteri causa malattie (Cosa sono i microbi, 2010).,
Il microbioma della cavità nasale è costituito principalmente da phyla Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria (Bassis et al. 2014). Il microbioma della cavità nasale può anche cambiare in risposta a fattori ambientali come la posizione geografica e l’igiene (Rawis et al. 2019).
Micrococcus luteus si trova in molti luoghi tra cui pelle, suolo, polvere, acqua, aria, bocca, mucose, orofaringe e tratto respiratorio superiore degli esseri umani (Wikipedia, Micrococcus luteus, 2019). È un microbo gram positivo a forma di coccus e contiene catalasi. Questo microbo forma grandi colonie rotonde., Può essere facilmente scambiato per stafilococchi, in quanto sono molto simili morfologicamente e fisiologicamente (Wikipedia, Staphlyococcus Aureus).
Il mio obiettivo in questo esperimento era quello di isolare, caratterizzare e identificare una colonia batterica nata da un campione prelevato dal naso del mio compagno di stanza. Ho ipotizzato che sarebbe un batterio che si trova comunemente nelle cavità nasali e probabilmente dai phyla di cui sopra, quindi probabilmente farebbe meglio a vivere in un ambiente aerobico, umido e caldo.
Metodi:
Ho scelto di campionare i batteri dal naso del mio compagno di stanza., Per campionare, ho usato tamponi di cotone sterili e li ho striati su piastre TSA. Ho mantenuto la piastra a temperatura ambiente per 7 giorni, e poi selezionato una colonia per purificare utilizzando il metodo pure culture streak plate. Ho ripetuto questo processo altre tre volte per purificare ulteriormente la colonia. Una volta che la coltura è stata ritenuta abbastanza pura, ho inoculato un tubo inclinato.
Ho eseguito molti test per scoprire la morfologia e la fisiologia della colonia., Al fine di determinare le caratteristiche fisiologiche della coltura come la forma delle cellule, la disposizione e se fosse gram positivo o negativo, che aiuta a determinare il tipo di parete cellulare del microbo, ho eseguito una macchia di gram. Ho usato una striscia reattiva ossidasi e acqua per determinare se il citocromo C ossidasi era presente, ed eseguito un test catalasi per determinare se catalasi era presente. Ho anche fatto un test del tioglicolato fluido per determinare la classe di ossigeno dei batteri., Ho coltivato i miei batteri su una piastra di eosina blu di metilene (EMB) per vedere se poteva fermentare il lattosio e se poteva crescere con blu di metilene che seleziona per i batteri gram negativi. L’ho anche coltivato in un piatto di MacConkey (MAC) per vedere se poteva fermentare il lattosio e se poteva crescere sia con il cristallo viola che con i sali biliari per confermare ulteriormente se era gram negativo o positivo. Ho usato un test API Strep per determinare più zuccheri che i batteri potrebbero fermentare.
Ho coltivato il mio isolato in brodo di soia triptica (TSB) per una settimana per prepararmi all’estrazione del DNA., Ho estratto il DNA utilizzando il kit DNA PowerSoil (prodotto da Qiagen) seguendo le istruzioni del produttore. Il campione è stato quindi sequenziato utilizzando la tecnologia Illumina MiSeq nel laboratorio DNA Core di UAF. Ho usato il software PATRIC per eseguire un metagenome binning e per assegnare una tassonomia ai batteri.
Risultati:
La colonia impiegò 16 giorni per essere purificata. La macchia di gram di questo microbo ha mostrato che è gram positivo perché si è macchiato di viola. Questo microbo è a forma di coccus e si forma in tetradi. La colonia si forma come un blob rotondo giallo e lucido., I test della catalasi e dell’ossidasi sono risultati negativi, perché il test della catalasi non ha formato bolle e il test dell’ossidasi non ha visto un cambiamento di colore. Il test dell’ossidasi verifica se il microbo contiene citocromo c ossidasi. Il test catalasi test per vedere se il microbo contiene catalasi. Il test del tioglicallato fluido ha dimostrato che il batterio era un aerobo obbligato perché la crescita era concentrata nella parte superiore del tubo nella regione rosa. L’agar MacConkey ha mostrato una crescita molto piccola e non ha avuto un cambiamento di colore, indicando che il microbo era gram positivo e non un fermentatore., L’agar EMB non ha mostrato alcuna crescita o cambiamento di colore, indicando anche che il microbo era gram positivo e non fermentatore.
L’assegnazione tassonomica di questo microbo era micrococcus luteus perché era l’unico contenitore dato da PATRIC. Aveva 27.372 contig in assemblea. Ha più geni di resistenza agli antibiotici tra cui diidropteroato sintasi, glicerofosforil diestere fosfodiesterasi e proteine ribosomiali SSU.
Figura 1. Il grafico Krona del microbo mostra le classi batteriche che si pensa siano presenti nel campione.
Figura 2., Kaiju webserver metagenome binning grafico di analisi. Mostra che il campione contiene batteri del gruppo Terrabatteri. È principalmente Actinobacteria, ma alcuni proteobatteri e Firmicules sono nel campione pure.
Il binning kaiju metagenome mostra che il campione di microbo non è completamente puro (Figura 2). Mostra che è principalmente Actinobacteria, con alcuni firmicoli e proteobatteri mescolati (Figura 2). Questo corrisponde con il binning metagenome PATRIC che ha anche mostrato alcune impurità (Figura 1).,
Discussione:
Poiché il microbo è gram positivo, ciò significa che ha un grande strato di peptidoglicano e manca di uno strato di lipopolisaccaride. L’agar MacConkey è selettivo per il gram-negativo, motivo per cui il mio microbo non ha mostrato molta crescita su di esso, e poiché non ha cambiato i colori significa che non ha fermentato il lattosio. La piastra EMB è anche selettiva per i batteri gram-negativi che è probabilmente il motivo per cui i batteri non sono cresciuti su di esso. La classe di ossigeno del microbo, obligate aerobe, corrisponde alle previsioni che avevo fatto su di esso perché il batterio era originariamente proveniente da una narice., Wikipedia dice anche che Micrococcus luteus è un aerobe obbligato, il backup di ciò che i miei risultati mostrano (2019).
I risultati del test ossidasi suggeriscono che il microbo non contiene ossidasi, nonostante ciò che il test di binning metagenome ha mostrato. Il test della catalasi ha anche indicato che il microbo non ha catalasi, nonostante il test di binning metagenomico lo suggerisca. Queste discrepanze potrebbero essere dovute a errore umano, cultura non pura o una vecchia piastra di agar., La mancanza di risultati delle strisce reattive API suggerisce che ho usato la striscia reattiva sbagliata, probabilmente avevo bisogno di usare il test dello stafilococco invece del test dello streptococco, perché il test dello streptococco è per quando la catalasi è assente, ma potrebbe esserci stata la catalasi presente. I risultati contrastanti del metagenome binning e il test catalasi influenzato questo errore. Penso che sulla base di tutte queste informazioni, che il mio microbo è in realtà micrococcus luteus come suggerito dal test di binning PATRIC metagenome, e la corona (Figura 1).
In conclusione, alcuni dei miei risultati sono stati inconcludenti e contrastanti., Questa è probabilmente una causa di errore umano, colture non pulite o non usando piastre di agar che sono abbastanza fresche per il test. Penso che questa cultura fosse per lo più Micrococcus luteus basato sui risultati di binning Kaiju e metagenome. Anche la classe di ossigeno e la positività gram del microbo corrispondono a quella del Micrococcus luteus. In futuro funziona con questo microbo, probabilmente vorrei purificare la cultura di più e rifare i test.
Bassis CM, AL Tang, VB Young, e MA Pynnonen (2014). Il microbiota della cavità nasale di adulti sani. Microbioma 2(27).,
Rawis M, e AK Ellis (2019). Il microbioma del naso. Annali di allergia, asma e immunologia 122 (1): 17-24.
(2010) Cosa sono i microbi? Istituto per la qualità e l’efficienza nell’assistenza sanitaria.