3.1.2.2. HPLC
HPLC utilizzando fasi mobili a base di acetonitrile o esano consente la rilevazione diretta dei fosfolipidi senza previa pulizia dell’estratto grezzo, rendendo così questi metodi semplici e rapidi. Tuttavia, questi metodi non separano efficacemente i diversi fosfolipidi inositolo. Il suo nome è Nak (1989) hanno sviluppato una procedura HPLC che analizza specificamente PtdIns e PtdInsP2 nel cervello., In questo metodo, l’estratto lipidico viene prima derivatizzato con 9-antrildiazometano per produrre (9-antril) PtdInsP e di(9-antril) PtdInsP2 e quindi il campione derivatizzato viene separato da HPLC con rilevamento UV a 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn e SM non sono derivatizzati con questo reagente e, quindi, non interferiscono con il test (Yamada et al., 1988). Questo metodo è più sensibile del metodo di rilevamento UV sottoivatizzato per l’analisi dei fosfolipidi inositolo.
Low (1990) ha descritto l’uso di colonne di cellulosa DEAE per HPLC preparativo dei lipidi cerebrali., I fosfolipidi cerebrali disciolti in 50 ml di solvente A (cloroformio/metanolo/H2O, 20:9:1, vol.) e applicato alla colonna di cellulosa (DEAE cellulosa, Sigma), che viene lavato con alcali e acido alla neutralità. La cellulosa DEAE lavata è confezionata in una colonna di vetro (2 cm × 38 cm) con raccordi resistenti ai solventi. La colonna viene quindi eluita ad una portata di 100 ml / h con gradiente lineare 1 1 dal 100% di solvente A al 100% di solvente B (Solvente A contenente 0,6 M di acetato di ammonio) e le frazioni 13-15 ml vengono raccolte e analizzate per il fosforo (Fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Isolamento delle PTDINSP dal cervello bovino mediante cromatografia a colonna DEAE-cellulosa. La frazione di folch precipitata con metanolo lavato con acido è stata eluita da una colonna di DEAE-cellulosa con un gradiente di solvente 100% A (cloroformio/mefanolo/H2O, 20:9:1, in vol.) al 100% del Solvente B (Solvente A contenente 0,6 M di acetato di ammonio) e 13-15 ml di frazioni raccolte. Le frazioni sono state analizzate per il fosforo organico. Il recupero medio del fosforo organico applicato è stato di circa il 90%., Il picco eluendo al numero di frazione. Venticinque era riproducibile presente, ma non è stato identificato. La composizione dei picchi è stata determinata dall’analisi TLC delle frazioni raggruppate. I picchi sono identificati come mostrato in figura.
Riprodotto da basso (1990) con il permesso dell’editore.
In alternativa, Low (1990) ha eseguito la fase cromatografica mediante HPLC preparativo utilizzando una colonna amminica. I fosfolipidi cerebrali sono stati sciolti in 5 ml di Solvente A e sono stati applicati ad una velocità di flusso di 2.,5 ml/min a 10 mm × 250 mm amino-NP colonna (5 µm silice sferica con n-propilammina legato fase, IBM Strumenti, Danbury, CT) con un 4.5 mm × 50 mm colonna di guardia equilibrato con il Solvente A. colonna viene eluito con una portata di 2,5 ml/min con 25 ml di Solvente, 125 ml di pendenza del 100% di Solvente a Solvente B al 100%, e 100 ml di Solvente B al 100%; 5 ml frazioni raccolte. Le frazioni raggruppate sono concentrate regolando a 18 ml con solvente A e i fosfolipidi estratti. Il recupero medio del fosforo organico è dell ‘ 80%., È stata ottenuta una separazione completa di PtdIns (90 ml), PtdInsP (150 ml) e PtdInsP2 (160-200 ml) (cromatogramma non mostrato). Il PtdIns, tuttavia, si sovrappone con PtdSer. La composizione dei picchi è stata determinata con TLC di frazioni raggruppate.
Basso (1990)ha anche descritto una purificazione HPLC delle PtdIne marcate(4)P e PtdIne(4,5) P2 da piastrine umane. L’estratto lipidico dalle piastrine è stato preparato da 60 ml di sangue umano fresco in presenza di PtdInsPs cerebrali bovini precipitati a metanolo come vettore, viene infine ridisciolto in 0.,5 1 di Solvente A e applicato ad una portata di 1 ml/min ad una colonna ammino-NP di 4,5 mm × 250 mm equilibrata nel Solvente A. La colonna viene eluita con 5 ml di Solvente A (un gradiente lineare di 25 ml dal 100% di Solvente A al 100% di Solvente B) e 20 ml di Solvente B. Vengono raccolte frazioni di un millilitro e la radioattività determinata dal conteggio della scintillazione liquida. Il recupero medio della radioattività applicata è di circa il 70%. C’è un’eccellente risoluzione dei tre fosfatidi inositolo, ma le ptdine si sovrappongono con PtdOH., Pertanto, questa procedura HPLC non è adatta per la preparazione di PtdIne poiché PtdOH, che nella maggior parte dei tipi di cellule è più rapidamente etichettato da Pi, non viene risolto da esso. È probabile che altri fosfolipidi anionici come PtdSer siano scarsamente risolti dalle PtdIne dalla colonna amino-NP, come osservato con la procedura DEAE-cellulosa.
Come discusso sopra, nessuno dei metodi di cui sopra è efficace nel separare i singoli PTDINSP in forma pura da estratti di tessuto grezzo. Pertanto, gli estratti lipidici devono essere elaborati da diversi passaggi cromatografici., A tale scopo, l’estratto viene prima sottoposto a cromatografia Sephadex per la separazione dei lipidi dai nonlipidi nell’estratto. La frazione lipidica viene quindi versata su una colonna DEAE che viene eluita con diversi solventi. Le PTDINSP vengono recuperate per eluizione con cloroformio / metanolo / sale di ammonio come fase finale di eluizione. Le singole frazioni sono concentrate a 100 µl a 45 ° C sotto azoto e quindi il residuo concentrato viene ulteriormente separato mediante cromatografia a cartuccia, TLC, HPLC o altre procedure cromatografiche.,
Singh (1992) ha descritto l’estrazione e l’analisi di PtdIns, PtdIns(4)P e PtdIns(4,5)P2 utilizzando una cartuccia Sep-Pak. Un estratto lipidico totale (Folch et al., 1957) di sinaptosomi e microvasi cerebrali di ratto è stato preparato per la prima volta e la prima frazione generata (Frazione 1) è stata raccolta e ulteriormente estratta per separare fosfolipidi e glicolipidi come descritto da Dugan et al. (1986). La frazione fosfolipidica è stata sottoposta a cromatografia DEAE-cellulosa (sequenza di separazione 4) come descritto da Rouser et al. (1969) per purificare ulteriormente i lipidi inositolo., L’estratto purificato è stato trasferito in una cartuccia Sep-Pak. Vari lipidi inositolo vengono eluiti dalla colonna con un gradiente lineare di acetato di ammonio e acqua dallo 0,5% di acetato di ammonio (200 mm) e dal 99,5% di acqua al 75% di acetato di ammonio e al 25% di acqua in 60 min ad una portata di 0,5 ml/min (vedi Capitolo 2). L’eluato della colonna per 120 min è stato raccolto in frazioni da 1 ml. Sono stati identificati diversi picchi utilizzando come punti di riferimento i picchi PtdIns, PtdIns(4)P e PtdIns(4,5)P2., Le frazioni contenenti singoli lipidi inositolo sono state raggruppate e analizzate da HPLC come descritto da Geurts van Kessel et al. (1977). I singoli fosfolipidi sono stati rilevati a 206 nm utilizzando un rivelatore a matrice di diodi programmato per scansionare un intervallo di 200-350 nm. Singh (1992) ha dimostrato il recupero del 50-90% di PTDIN e INSP da campioni cerebrali. InsP3 e InsP4 hanno mostrato il recupero più basso a causa di una scarsa quantificazione piuttosto che di un metodo di estrazione scadente. I metodi della cartuccia non sono stati applicati per l’isolamento delle PTDIN(3)P, ptdin(3,4)P2 e ptdin (3,4,5)P3.
Cronholm et al., (1992) hanno descritto l’isolamento delle PTDINSP dal pancreas di ratto. Ogni pancreas è stato immediatamente omogeneizzato in 3 ml di cloroformio / metanolo(1: 2, v/v) e circa 3 MBq di PtdIne marcate 3H(4)P o PtdIne (4,5)P2 sono stati aggiunti insieme a 0,6 ml di 1,2 aq. HCl prima dell’estrazione con cloroformio, come descritto da Schacht (1981). Il metanolo è stato aggiunto agli estratti raggruppati e lavati per produrre cloroformio/metanolo (3:2, v/v). La soluzione è stata applicata alla colonna Lipidex-DEAE, e la maggior parte dei lipidi sono stati eluiti con cloroformio/metanolo (3:2, v/v) o cloroformio/metanolo/acqua (3:6:1 vol.)., PtdIns e PtdSer sono stati eluiti insieme a 0,03 M H3PO4 e materiale non identificato con 0,1 M H3PO4. PtdIns(4)P è stato eluito con 0,25 M H3PO4 e PtdIns (4,5) P2 con 0,5 M H3PO4 come indicato dalla radioattività elutata. Tutte le frazioni sono state estratte con 0,4 ml di acqua/ml di eluato. La fase superiore è stata estratta con 0.1 vol. di cloroformio. Le fasi di cloroformio raggruppate sono state lavate con 0,4 vol. di 0,5 M HCl in 50% aq. metanolo. Le frazioni sono state utilizzate per la determinazione delle specie molecolari mediante FAB / MS (vedi sotto).
Gunnarsson et al., (1997) utilizzato HPLC in fase normale con rilevamento di dispersione della luce evaporativa per l’analisi di campioni commerciali di PTDINSP insieme ad altri fosfolipidi. Utilizzando un gradiente lineare di A, cloroformio / metanolo / ammoniaca (50: 45: 3, vol.) e B, cloroformio / metanolo / acqua / ammoniaca (25: 55: 17: 3, vol.)si ottengono picchi emergenti tardivi ben risolti per PTDIN(4)P e PTDIN(4,5) P2. Le curve dose-risposta per le PtdIne (4)P e le PtdIne(4,5) P2 non erano lineari, il che è una caratteristica del rivelatore di dispersione della luce (risultati non mostrati)., Per la maggior parte degli scopi la tecnica di HPLC è superiore nella risoluzione, nella velocità e nella convenienza globale alla procedura DEAE-cellulosa ed è il metodo della scelta se l’attrezzatura di HPLC è disponibile. La DEAE-cellulosa è economica e la purificazione su larga scala potrebbe richiedere l’uso di questo materiale. La procedura HPLC è anche superiore ad alcuni o in tutti gli aspetti a procedure alternative per la purificazione dei polifosfoinositidi, ad esempio TLC preparativo o cromatografia di affinità con neomicina.