Introduzione
L’ambergris, un noto prodotto naturale del capodoglio, si trova anche come jetsam sulle spiagge di tutto il mondo ed è stato molto apprezzato per la sua utilità nell’industria dei profumi . Anche se è stato a lungo sostenuto che il jetsam ambergris raccolti sulle spiagge proviene da capodogli , poca o nessuna prova per questo è mai stato pubblicato, e distinzioni esistono tra tali campioni e campioni di ambergris prelevati direttamente dai capodogli., Ad esempio, i campioni di ambergris di jetsam contengono generalmente proporzioni molto più elevate di ambreina di alcol triterpenoide e proporzioni molto più basse di steroli rispetto ai campioni di ambergris dai capodogli . Al contrario, tuttavia, jetsam ambergris a volte contiene frammenti di becchi di calamari, e poiché i cefalopodi, come i calamari, costituiscono la principale componente alimentare dei capodogli, questo è stato citato come prova di un’origine dei coproliti di jetsam dai capodogli. È anche teorizzato che l’ambra grigia può originare come secrezione patologica dall’irritante della chitina dura del becco del calamaro ., Tuttavia , altre specie di mammiferi marini (ad esempio membri di Globicephala e Ziphiidae) predano anche sui calamari, e alcuni (tra cui capodogli nani e pigmei) sono anche citati come potenziali fonti di ambra grigia . Pertanto, per chiarire ulteriormente l’origine di jetsam ambergris, abbiamo analizzato il DNA da un campione di ambergris raccolto da un capodoglio spiaggiato nei Paesi Bassi e confrontato con sequenze di DNA isolate da jetsam ambergris raccolte da spiagge in Nuova Zelanda e Sri Lanka.,
Ambergris è considerato prevalentemente composto da ambreina a causa della sua produzione da squalene, un prodotto metabolico comune in molti organismi . Questo processo può essere indotto dall’influenza microbica intestinale e precipita in masse dense e solide all’interno del colon della balena . Le accrescimenti coprolitici che risultano sono compositivamente ben adatte a preservare il DNA dal colon poiché l’ambreina è idrofobica e apparentemente resistente alla degradazione all’interno dell’ambiente enterico acido., Prove da radiocarbonio incontri indica certamente resistenza alla microbica e foto-degradazione in ambiente marino per un massimo di un millennio in alcuni campioni jetsam ambergris . Abbiamo ipotizzato che tale materiale potrebbe fornire una cache opportuno per preservare il DNA, anche dopo l’esposizione prolungata a condizioni dannose in mare.
Materiale e metodi
Jetsam sono stati analizzati esemplari di ambergris provenienti dal Mare del Nord, dall’Oceano Indiano e dal Pacifico, rappresentando la distribuzione globale del materiale ., Tre esemplari di jetsam ambergris (uno proveniente dallo Sri Lanka, due dall’isola di Pitt, Nuova Zelanda) sono stati sottocampionati per l’estrazione del DNA. Un quarto esemplare è nato dalla dissezione di un capodoglio maschio spiaggiato nel dicembre 2012, a Razende Bol vicino a Texel, nei Paesi Bassi. Quest’ultima ambra grigia “fresca”, proveniente da una carcassa confermata di capodoglio, ha fornito un confronto noto con gli esemplari di jetsam con storia biologica non confermata. Campioni di ambergris sono stati ottenuti e analizzati per il contenuto di ambreina e steroli fecali in studi precedenti .,
L’estrazione e il sequenziamento del DNA sono stati effettuati presso il GLOBE Institute, Università di Copenhagen, in un laboratorio dedicato al DNA antico seguendo rigorose procedure per ridurre al minimo la contaminazione. Circa 120 mg sono stati sottocampionati (figura 1 e tabella 1) per l’estrazione del DNA. I campioni sono stati incubati in tampone contenente 400 µl di proteinasi K dopo Gilbert et al. a 56°C per 10 h; i surnatanti sono stati quindi trattati con una fase di fenolo-cloroformio dopo Carøe et al., e purificato utilizzando colonne di pulizia del DNA Monarch (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) secondo le linee guida del produttore. Le librerie a doppio filamento sono state costruite con estratti di DNA seguendo il MIGLIOR protocollo, progettate e provate specificamente per il sequenziamento di DNA antico e degradato. Le librerie sono state amplificate e indicizzate tramite PCR utilizzando PfuTurbo Cx Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) secondo le linee guida del produttore., I prodotti sono stati raggruppati a concentrazione equimolare prima del sequenziamento su una piattaforma Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA), utilizzando 80 bp single end read chemistry presso il Danish National High-throughput DNA Sequencing Centre, Copenhagen, Danimarca.
Figura 1. Dettagli per i campioni di ambra grigia analizzati. (a) Mappa che mostra le località in cui sono stati originariamente trovati campioni di ambra grigia., (b) Fotografie che mostrano un’elevata diversità nelle caratteristiche fisiche dei frammenti di ambergris: TEXEL151212 (da un esemplare di balena sezionato) era granuloso nella consistenza, mentre i campioni di jetsam apparivano superficialmente più densi ed eterogenei, ed erano internamente equigranulari e di colore significativamente più chiaro.
| esempio | posizione | massa totale (g) | analizzati massa (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Isola, Nuova Zelanda | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | ovest dello Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Paesi bassi | 83000 | 92 | 93 |
| esempio | totale conservati legge | medio mantenuto leggi di lunghezza (bp) | totale allineati legge (mtDNA) | tempi di copertura (mtDNA) | totale allineati legge (intero genoma) | tempi di copertura dell’intero genoma) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
L’analisi delle sequenze è stata effettuata sulla struttura di calcolo ad alte prestazioni dell’Università di Copenaghen, con i file FASTQ elaborati utilizzando la pipeline PALEOMIX (v. 1.2.13) . FastQC v. 0.11.8 è stato inizialmente utilizzato per il controllo di qualità dei dati di sequenza grezzi. Gli adattatori sono stati tagliati usando AdapterRemoval v. 2.3.1, con letture inferiori a 25 bp anche rimosse. Le letture sono state quindi mappate su sequenze di riferimento utilizzando BWA, applicando anche mapDamage2.,0 per la quantificazione di degradazione di base, producendo allineamenti con sequenze di riferimenti. ANGSD è stato poi utilizzato per produrre sequenze in formato FASTA.
L’incertezza circa l’origine e i meccanismi biologici per la produzione di ambergris ci ha spinto a considerare più possibili specie di cetacei e pinnipedi candidati in analisi di sequenza. L’identità della specie è stata dedotta dal successo della mappatura e dalla relazione filogenetica con 19 specie candidate di cetacei e pinnipedi in NCBI RefSeq (vedere il materiale supplementare elettronico)., Queste specie sono state selezionate in base alla potenziale idoneità come mammiferi marini di immersione profonda che riempiono una nicchia ecologica simile ai capodogli, per escludere che tali specie siano co-adattate per produrre ambra grigia. Le sequenze di esempio sono state concatenate e allineate usando MAFFT v. 7.392 . I modelli ad albero filogenetico sono stati quindi prodotti in MEGA X usando il metodo della massima verosimiglianza con il modello Hasegawa-Kishino-Yano , con distanze stimate dall’approccio della massima verosimiglianza composita (i dettagli di tutte le sequenze di riferimento utilizzate sono inclusi nel materiale supplementare elettronico).,
Risultati
Le analisi filogenetiche hanno sostenuto inequivocabilmente l’origine del capodoglio dei quattro campioni di ambra grigia (figura 2; materiale supplementare elettronico, figura S1). Allo stesso modo, l’allineamento con il genoma di riferimento mitocondriale Physeter macrocephalus di NCBI (NC_002503.2) ha prodotto i risultati di copertura più elevati per tutti i campioni di tutti gli allineamenti effettuati e fornisce un’attribuzione sicura, anche se con variazioni significative nel successo tra i campioni. Sequenziamento del campione da un capodoglio incagliato (TEXEL151212) ha prodotto di gran lunga la più alta copertura (ca., 20×) per il capodoglio mitocondrione, mentre uno dei campioni jetsam di Pitt Island (S. 01) ha prodotto solo una copertura di circa 0,2× (vedere tabella 2). Allineamenti con i genomi mitocondriali di riferimento Kogia sima (capodoglio nano) e Kogia breviceps (capodoglio pigmeo) (NC_041303.1, NC_005272.1) hanno anche prodotto una copertura (dettagli in materiale supplementare elettronico), sebbene molte regioni funzionali altamente conservate siano condivise tra le specie analizzate, con conseguente elevata somiglianza di sequenza . Tuttavia, la copertura per le specie di kogiid era tipicamente di circa un fattore di 10 in meno rispetto al Physeter., Anche l’allineamento con l’intero genoma di riferimento nucleare di P. macrocephalus (ASM283717v2) ha avuto successo, sebbene ciò sia più evidente nei confronti del numero totale di letture mappate sul genoma. L’allineamento per Architeuthis dux (calamaro gigante), una reputata preda comune dei capodogli (ad esempio ), non ha avuto successo, ma questa non è la loro preda predominante .
Figura 2. Modello ad albero filogenetico di massima verosimiglianza generato da sequenze di riferimento e genomi mitocondriali campione allineati., I campioni sono chiaramente situati come raggruppamento con capodoglio (P. macrocephalus) piuttosto che capodogli nani e pigmei (Kogia spp.). Questo albero riflette il più alto modello di log-verosimiglianza, i valori riflettono la percentuale di alberi calcolati in cui i taxa associati sono stati raggruppati, indicando la fiducia nel posizionamento, e le lunghezze dei rami misurano il numero di sostituzioni in ciascun sito (vedi scala). Figura prodotta in MEGA X . Raffigurazioni di balene da: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Un albero filogenetico che comprende tutte le 19 specie candidate è presentato in materiale supplementare elettronico, figura S1.
I risultati di MapDamage mostrano variazioni inter-campione notevolmente ridotte che influenzano le transizioni da C a T alle estremità del filo 5′, sebbene esista una percentuale più elevata di transizioni da G a A all’estremità 3′ per S. 01 (dettagli in materiale supplementare elettronico, figura S2), indicando una possibile degradazione biomolecolare più elevata., In generale, tuttavia, si sono verificate pochissime modificazioni chimiche e la distribuzione delle alterazioni tra i fili rimane uniforme e piatta.
Discussione
Questo studio ha dimostrato che tre campioni di jetsam ambergris possono essere tranquillamente attribuiti al capodoglio attraverso l’estrazione del DNA. Mentre la conferma di un’origine di capodoglio per jetsam ambergris non è un risultato sorprendente, il presente studio è il primo a fornire un significativo proof-of-concept nel recupero del DNA endogeno da ambergris e utilizzarlo con successo per l’identificazione dell’organismo., È importante sottolineare che l’origine di tutti e tre i campioni di jetsam ambergris studiati qui può essere tranquillamente identificata come capodoglio sulla base non solo del successo dell’allineamento genetico, ma anche della modellazione dei genomi mitocondriali negli alberi di parentela filogenetica, anche per un ampio campione di taxa di mammiferi marini fuori gruppo., Tuttavia, anche se tutti i campioni analizzati qui sono stati identificati come provenienti da capodoglio, è ancora del tutto possibile che altri mammiferi marini di immersione profonda strettamente correlati (come i capodogli nani e pigmei) potrebbero produrre ambra grigia e semplicemente non sono ancora stati registrati come farlo fino ad oggi.
La causa predominante della drammatica variazione della copertura genetica osservata tra i campioni non è chiara. Analisi della degradazione del DNA in mapDamage2.,0 mostra poca correlazione con le coperture di allineamento, come ci si potrebbe aspettare, e c’è anche poca variazione tra il contenuto di ambreina nei campioni che ci si potrebbe aspettare contribuiscano alla conservazione differenziale del DNA. L’età precisa degli attuali campioni di jetsam è sconosciuta, sebbene studi precedenti abbiano datato con successo al radiocarbonio altri campioni di ambergris . Tuttavia, la datazione al radiocarbonio di campioni relativamente recenti è problematica a causa dell’impatto delle emissioni di combustibili fossili e le date al radiocarbonio in quanto l’aumento del rilascio di carbonio antropico sono inaffidabili., Produrre un tasso di degradazione costante per le transizioni da G a A in campioni datati in modo affidabile potrebbe, in futuro, aiutare a comprendere meglio il danno differenziale al DNA. Un’altra opzione per la ricerca futura potrebbe essere studi di deamidazione della glutammina e racemizzazione dell’acido aspartico dall’analisi di peptidi organici eventualmente presenti anche in ambergris . In alternativa, tuttavia, la variazione intra-campione nella concentrazione di DNA e ambreina potrebbe altrettanto probabilmente spiegare una bassa copertura nel campione S.,01, mentre più recente esposizione al tessuto capodoglio rappresenta senza dubbio per l’elevata copertura in spiaggiati campione balena TEXEL151212.
Il potenziale di conservazione dei precipitati di ambreina per il DNA si estende non solo alla genetica endogena delle balene, ma anche alla copertura metagenomica del microbioma intestinale delle balene e potenzialmente anche al DNA delle loro prede. Ad esempio , il DNA può anche rimanere all’interno di becchi di calamaro parzialmente o non digeriti trovati nelle feci di capodoglio e in ambergris , che sono anche teorizzati come una causa patologica della secrezione di ambergris ., La comprensione della composizione procariotica dell’ambiente del microbioma in ambergris potrebbe anche chiarire ulteriormente l’origine di ambergris, in particolare nella conversione dello squalene in ambreina e nel processo mediante il quale l’ambergris sembra formarsi in strati di accrescimento. Ulteriori analisi sul recupero del DNA endogeno da jetsam ambergris, incluso anche il DNA dal microbiota intestinale delle balene e dalla preda, fornirebbero informazioni significativamente maggiori sull’ecologia, l’evoluzione e il metabolismo dei capodogli.,
Conclusione
Jetsam ambergris è stato a lungo un materiale enigmatico, oggetto di discussione e analisi nelle pubblicazioni scientifiche a partire dal XVIII secolo . Questo studio è il primo a nostra conoscenza per presentare la conferma finale dell’origine biologica dei campioni di jetsam ambergris come capodogli, attraverso l’analisi del DNA. Al di là di questo, tuttavia, il presente studio delinea il potenziale di ambergris come una nuova fonte di dati genetici relativi ai capodogli con una notevole longevità nel tempo., Una maggiore delucidazione deve ancora essere raggiunta attraverso lo studio delle condizioni di conservazione del DNA in ambreina e degli effetti differenziali da più fattori. Tuttavia, le potenziali implicazioni per aiutare la nostra comprensione delle dinamiche di popolazione passate nelle balene e dei loro taxa ecologicamente associati possono essere profonde. Il più antico noto ambergris trovato all ” interno depositi pleistocenici presentano becchi calamari permineralizzati contenenti aminoacidi endogeni al calamaro, che gli autori attribuiscono alla capacità conservativa del sedimento locale ., Sebbene sia improbabile che il DNA venga conservato per una tale età (1,75 Ma), questo risultato potrebbe anche essere attribuibile all’efficacia di ambergris e ambrein come substrati di conservazione. Molto è ancora sconosciuto sull’ecologia e l’adattamento dei giganti marini precedentemente caratterizzati come bestie semi-mitiche, e l’ambra grigia potrebbe ora rivelarsi una piccola ma significativa chiave per comprendere alcuni ulteriori aspetti di essi.
Etica
Tutti i campioni sono stati ottenuti e analizzati eticamente in questo studio, parte del progetto DNRF-128 PROTEIOS., Dei quattro campioni di ambergri analizzati in questo studio, tre (S. 01-S. 03) sono stati sottocampionati da materiale studiato da S. J. R. in pubblicazioni precedenti (vedi sopra), ottenuti come ambergri jetsam trovati sulle spiagge (campione n.ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 e ACL237-S. 03). Il quarto campione (TEXEL151212) è stato gentilmente fornito come sottocampione del campione ambergris TEXEL151212 dal Dr A. Oosterbaan per conto del Museo EcoMare, Texel, Paesi Bassi, dove il resto di questo campione è ancora conservato. Siamo grati per il permesso del museo di utilizzare questo campione.,
Accessibilità dei dati
Contributi degli autori
Interessi concorrenti
Dichiariamo di non avere interessi concorrenti.
Finanziamento
Il finanziamento è stato fornito dal Danish National Research Foundation grant PROTEIOS (DNRF128).
Ringraziamenti
R. M. è grato al dottor J. A. Samaniego per consigli sulle analisi genomiche, e anche a M. McCarthy per consigli e discussioni. Siamo grati al dottor A. Oosterbaan (Ecomare Museum, Texel) per il campione S. 04 e ai collezionisti anonimi per i campioni S. 01–S. 03., Gli autori vorrebbero riconoscere l’assistenza del Centro nazionale danese di sequenziamento ad alto throughput nella generazione di dati Illumina.
Note a piè di pagina
Il materiale supplementare elettronico è disponibile online all’indirizzo https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
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