Caratteristiche topologiche delle reti metaboliche C3 e C4
Il modello metabolico di Arabidopsis AraGEM include 1498 reazioni uniche, 1765 metaboliti, 83 trasportatori interorganellari e 18 trasportatori inter-cellulari . Per il modello di metabolismo delle piante C4 C4GEM, ci sono 2377 reazioni, 2886 metaboliti, 177 trasportatori inter-organelli e 23 trasportatori esterni ., Le proprietà topologiche dei modelli AraGEM e C4GEM sono state analizzate usando pajek , dove le reazioni sono rappresentate come nodi e metaboliti come bordi. Alcuni parametri topologici importanti come il grado medio, la centralità tra i due modelli, il coefficiente medio di clustering e la distanza sono stati confrontati tra questi due modelli, come mostrato nella Tabella 1.I risultati hanno dimostrato che l’AraGEM ha una struttura più densa di C4GEM, perché la pianta C3 è unicellulare, mentre la pianta C4 è costituita da cellule mesofille e cellule di guaina del fascio, le connessioni tra due cellule non sono così vicine come le cellule singole., Quindi abbiamo estratto il metabolismo primario dalle reti C3 e C4, tra cui il ciclo di Calvin, la fotorespirazione, il ciclo TCA, il metabolismo dell’azoto, il metabolismo del saccarosio e dell’amido e alcune importanti vie del metabolismo degli aminoacidi. Usando NET-SYNTHESIS, abbiamo calcolato la ridondanza della rete metabolica primaria di C3 e C4, che è rispettivamente 0,7175 e 0,7606. Significa che la rete C4 è più ridondante in modo che l’impianto C4 potrebbe essere più robusto alla mutazione del gene o cambiamenti ambientali.,
Improved models by setting the ratio of carboxylation and oxygenation by Rubisco
Rubisco enzyme (EC: 4.1.1.,39) catalizzata da due reazioni diverse, con emissioni di CO2 e di O2, rispettivamente, nella fotosintesi e photorespiration:
C’è un rapporto costante tra il tasso di carbossilazione e l’ossigenazione specifici sotto la pressione parziale di CO2 e O2 in ambiente ., Pertanto, è difficile simulare con precisione il cambiamento di flusso sotto diverse concentrazioni di CO2 senza vincoli sulla velocità delle due reazioni di Rubisco, che è solo la limitazione di AraGEM e C4GEM. Qui abbiamo migliorato i due modelli, combinando le due reazioni in una reazione:
Il rapporto r tra di carbossilazione e l’ossigenazione in diversa concentrazione di CO2 in C3 e C4 modello è illustrato nella Tabella 2., Il calcolo dei dettagli di r si trova nella sezione Metodi.
In aggiunta, la nostra motivazione era di confrontare le differenze tra C3 e C4 fotosintesi meccanismo e le loro risposte in ambienti diversi, quindi abbiamo impostato la funzione obiettivo come massimizzazione di CO2 per il fissaggio e la biomassa di sintesi., Poiché nei precedenti AraGEM e C4GEM, l’obiettivo era quello di ridurre al minimo l’uso di energia luminosa raggiungendo un tasso di crescita specificato, abbiamo bisogno di ripristinare alcuni vincoli di flusso in base alle conoscenze biochimiche. Ad esempio, la perdita di CO2 è stata bloccata dalla guaina del fascio alla cellula mesofilla con flusso zero in C4GEM, che non era coerente con la situazione reale; qui abbiamo regolato il limite superiore di questa reazione per consentire la perdita di CO2. Inoltre, poiché l’amido non è sintetizzato nella cellula mesofilla delle piante C4, anche i componenti della biomassa di C4GEM sono stati ripristinati., I limiti inferiore e superiore del flusso nel ciclo TCA sono stati regolati come -50 e 50, per limitare il flusso di respirazione nei mitocondri. Il dettaglio dei vincoli modificati nei nostri modelli migliorati può essere ottenuto dal file aggiuntivo.
Gli effetti degli enzimi knock-out sul flusso metabolico
Sulla base delle reti metaboliche C3 e C4 migliorate, abbiamo confrontato il flusso ottimale di sintesi della biomassa e la fissazione della CO2 utilizzando FBA. Quando la sintesi della biomassa è la funzione oggettiva, il flusso massimo di biomassa è 3.661 e 4.625 mmol·gDW-1·hr-1 rispettivamente nelle reti C3 e C4., Allo stesso modo, quando si ottimizza la fissazione della CO2, il flusso massimo è 200,95 mmol·gDW-1·hr-1 nella rete C3 e 387,619 mmol·gDW-1·hr-1 nella rete C4. Ha dimostrato che la rete C4 presentava sia flussi più elevati di biomassa che fissazione di CO2 rispetto alla rete C3, il che era coerente con la tendenza effettiva. Abbiamo concluso che le due reti metaboliche su scala genomica potrebbero spiegare situazioni reali ed essere confrontate per comprendere le somiglianze e le differenze delle piante C3 e C4.
Successivamente, abbiamo valutato gli effetti dei knockout enzimatici sul flusso di fissazione della CO2 e sulla biomassa., Quando un enzima era knockout, le sue reazioni corrispondenti sarebbero state cancellate, il che ha portato a cambiamenti del flusso ottimale di biomassa o fissazione di CO2. I risultati oggettivi della simulazione sono stati classificati come obiettivo invariato (rapporto = 1), obiettivo ridotto (rapporto ∈ (0, 1)) e nessun obiettivo (rapporto = 0). Gli effetti della delezione a reazione singola sul flusso massimo di biomassa nelle reti C3 e C4 sono illustrati nella tabella 3. Oltre l ‘ 85% delle reazioni non ha effetti sulla biomassa massima della rete C3 e C4 quando viene eliminata, quindi abbiamo concluso che le due reti hanno una robustezza sorprendente., Quasi il 10% delle reazioni si tradurrebbe in zero biomassa nelle reti C3 e C4, che includono alcuni importanti trasportatori. La singola delezione di importanti reazioni o enzimi come la fosforibulochinasi (PRK, EC: 2.7.1.19) e le reazioni alla luce possono provocare l’assenza di biomassa, il che è coerente con le reali caratteristiche delle piante .,
Gli effetti della reazione di eliminazione in C3 e C4 reti funzione obiettivo è la fissazione di CO2 sono riportati nella Tabella 4, che è simile con la Tabella 3. Oltre il 96% delle reazioni non ha alcuna influenza sul flusso massimo di fissazione della CO2 quando viene eliminato nelle reti C3 e C4. Abbiamo concluso che più reazioni non hanno alcuna influenza sul flusso massimo di fissazione della CO2 rispetto alla biomassa., Poiché la sintesi della biomassa include molti componenti che si occupano di più di una reazione, la loro delezione influenzerà il flusso della sintesi della biomassa. Inoltre, è ovvio che le piante C4 presentano una robustezza molto migliore rispetto alle piante C3, poiché una percentuale più elevata di knockout enzimatici non comporta alcun cambiamento sul flusso obiettivo e una percentuale inferiore produce un flusso zero. Inoltre, abbiamo scoperto che tutte le reazioni essenziali nella rete C3 sono essenziali anche per C4, mentre ci sono alcune altre reazioni specificamente essenziali per C4., Questo risultato ha dimostrato che il metabolismo di base delle piante C4 era simile a C3, ma C4 è diventato più complesso durante il lungo periodo di evoluzione.
Abbiamo scoperto che ci sono alcune lacune in C4GEM quando si controlla il percorso dello xilosio nelle due reti. In AraGEM, ci sono due vie per produrre xilosio, così knockout di UDP-glucosio 6-deidrogenasi (UDPGDH, EC:1.1.1.22) non influenzerà sulla sintesi della biomassa., Ma in C4GEM, solo UDPGDH era responsabile della produzione di xilosio, l’altra via alternativa non funziona a causa di due enzimi mancanti, xilosio isomerasi (EC: 5.3.1.5) e xilulochinasi (EC:2.7.1.17). Abbiamo cercato nel database GeneBank per trovare che i geni (GeneID: 100194128, 100194385) codifica xilosio isomerasi e geni (GeneID:100282641, 100382670) codifica xilulochinasi. Quindi abbiamo completato la via dello xilosio in C4GEM, quindi i risultati distorti possono essere evitati.
Successivamente abbiamo studiato gli effetti di particolari enzimi chiave sulla fotosintesi e sulla sintesi della biomassa nelle piante C3 e C4., La tabella 5 illustra questi enzimi, le loro funzioni e il rapporto tra flusso obiettivo dopo la delezione. “0” indica l’enzima eliminato che non produce alcun flusso di biomassa o fissazione di CO2, mentre ” 1 ” indica che non vi è alcuna influenza sul flusso massimo di biomassa o fissazione di CO2. Knockouts di enzimi nel ciclo di Calvin hanno effetti letali su entrambe le reti C3 e C4. Ad esempio, l’enzima centrale del ciclo di Calvin, Rubisco (EC: 4.1.1.39) catalizza la fissazione di CO2 e O2., La sua delezione si traduce in un flusso zero di fissazione di CO2 e biomassa, che si accorda con il fatto che la fotosintesi e la crescita delle piante sono positivamente correlate con l’attività di Rubisco . Quando si eliminano la transaldolasi (TAL, EC: 2.2.1.2) nella via del pentoso fosfato e la glicolato ossidasi (LOX, EC: 1.1.3.15) nella via del metabolismo del gliossilato e del dicarbossilato, anche la fissazione della CO2 e la biomassa ridurranno a zero il flusso in queste due piante . Aconitasi (EC: 4.2.1.3) è un enzima importante nel ciclo TCA, il suo knockout ha ridotto il flusso di fissazione di CO2 e completamente nessun flusso di biomassa nelle reti C3 e C4 .,
L’eliminazione di hosphoglycolate fosfatasi (PGLP, CE: 3.1.3.18) non ha alcun effetto sulle emissioni di CO2 per il fissaggio e la biomassa sintesi, perché catalizza la prima reazione della photorespiratory C2 ciclo . Saccarosio-6 (F) – fosfato fosfoidrolasi (SPP, EC: 3.1.3.24) catalizza la fase finale nella via della biosintesi del saccarosio ., La sua delezione non ha alcuna influenza, perché la sintesi del saccarosio si trova nel citosol e non ha alcuna connessione diretta con la fotosintesi. L’amilasi isomerasi (EC: 2.4.1.18) è responsabile della sintesi dell’amido transitorio nel cloroplasto, che è la reazione critica per la normale biosintesi dell’amido di stoccaggio, quindi la sua delezione ha un effetto letale sul flusso di biomassa sia per le piante C3 che C4 .
Negli impianti C4, Fosfoenolpiruvato carbossilasi (PEPC, EC: 4.1.1.,31) esegue in particolare la fissazione iniziale della CO2 atmosferica nella fotosintesi, che catalizza la carbossilazione del fosfoenolpiruvato (PEP) in una reazione che produce ossaloacetato e fosfato inorganico . Pertanto, knockout di PEPC ha portato a zero flusso di biomassa, che convalida il suo ruolo cruciale nella fotosintesi C4. Piruvato fosfato dikinase (PPDK, EC: 2.7.9.1) catalizza la conversione del composto piruvato 3-carbonio in fosfoenolpiruvato., La sua delezione ha ridotto il flusso di fissazione di CO2 e biomassa, che è coerente con i risultati dell’esperimento che l’inibizione di PPDK ostacola significativamente la crescita delle piante C4 . In confronto, questi due enzimi non hanno alcun effetto sulla fissazione della CO2 e sulla biomassa nella rete C3.
Insiemi di reazione correlati identificati mediante campionamento
Ci sono alcune reazioni co-utilizzate in precisi rapporti stechiometrici e mostrano un flusso correlato nella rete metabolica, che ha chiamato insiemi di reazione correlati., Abbiamo usato il metodo di campionamento casuale uniforme per determinare le dipendenze tra le reazioni che possono essere ulteriormente utilizzate per definire moduli di reazioni . Il modello semplificato della rete C3 ha 494 reazioni, 483 metaboliti e una gamma ristretta di vincoli, che possono essere separati in 65 moduli e il modulo più grande è costituito da 92 reazioni. Il modello semplificato della rete C4 ha 826 reazioni, 806 metaboliti e una gamma ristretta di vincoli, che possono essere separati in 113 moduli e il modulo più grande è costituito da 169 reazioni. Ci sono più gruppi di reazione correlati in C4 rispetto alla rete C3.,
I flussi di reazioni nello stesso modulo mostrano correlazione lineare. Abbiamo trovato le reazioni nel ciclo di Calvin sono correlati sia in rete C3 e C4, come illustrato in Figura 3 e 4 rispettivamente. Tuttavia, ci sono alcune reazioni da diversi percorsi che mostrano anche una correlazione lineare nella rete C4, ma non sono correlate nel modello C3., Ad esempio, le reazioni da metabolismo dello zucchero, Stibene, counarine e lignina biosintesi, e percorsi biosintesi cumarina e fenilpropanoide sono significativamente correlati in C4 (mostrato in Figura 5), ma nessuna correlazione tra loro in C3 (mostrato in Figura 6). Ha dimostrato che le piante C4 hanno una migliore modularità con un meccanismo complesso che coordina le reazioni e i percorsi rispetto a quello delle piante C3.
Insiemi di reazioni correlate del ciclo di Calvin nella rete C3.,
Correlated reaction sets of Calvin cycle in C4 network.
The reactions from several pathways are correlated in C4 network.,
Le reazioni da diversi percorsi stessi con C4 non sono correlati in rete C3.
Confronto della risposta alle diverse condizioni ambientali
La fissazione della biomassa e della CO2 dei modelli C3 e C4 è stata simulata con intensità luminosa diversa, come mostrato nelle Figure 7 e 8., Il modello C3 (rosso nella figura 7) e il modello C4 (blu nella figura 7) hanno presentato una relazione lineare tra biomassa e intensità luminosa quando l’intensità della luce è inferiore a 1500. Quindi, con l’aumento dell’intensità luminosa, la biomassa sarebbe invariata nel modello C4 e ancora aumentata nel modello C3. Il modello C3 (rosso nella figura 8) e il modello C4 (blu nella Figura 8) hanno anche presentato una relazione lineare tra fissazione di CO2 e intensità della luce quando l’intensità della luce è inferiore a 1600. Quindi la fissazione della CO2 era quasi rimasta invariata., L’aumento sia della biomassa che della fissazione della CO2 con l’intensità della luce in C4 sono più veloci di quelli in C3, che riflettono un uso più efficiente dell’energia solare negli impianti C4 . Inoltre, abbiamo simulato il flusso di sintesi della biomassa e la fissazione di CO2 sotto diverse concentrazioni di CO2, come mostrato nelle figure 9 e 10. Più aumenta la concentrazione di CO2, più flusso di biomassa e fissazione di CO2 e l’aumento cambia gradualmente lentamente fino allo stato stazionario. La curva simulata era coerente con la curva A-Ci dell’esperimento ., Abbiamo scoperto che l’aumento sia della biomassa che della fissazione di CO2 con la concentrazione di CO2 in C4 sono più veloci di quelli in C3, il che riflette un uso più efficiente della CO2 negli impianti C4.
L’effetto dell’intensità luminosa sulla sintesi della biomassa nel modello C3 e C4.
Il effetto dell’intensità luminosa sulla fissazione di CO 2 nel modello C3 e C4.,
The effect of CO 2 concentration on biomass synthesis in C3 and C4 model.
The effect of CO 2 concentration on CO 2 fixation in C3 and C4 model.,
Contributo di diversi sottotipi C4 alla produzione di biomassa
Le piante C4 possono essere classificate in tre sottotipi secondo le modalità di decarbossilazione: enzima NADP-malico (NADP-ME), enzima NAD-malico (NAD-ME) e PEP carbossichinasi (PCK). Abbiamo esplorato l’influenza di ciascun sottotipo sulla sintesi della biomassa e sulla fissazione della CO2, bloccando il flusso di altri due enzimi e fornendo una quantità sufficiente di acqua e azoto. Come mostrato nella Tabella 6, per ogni sottotipo specifico, solo l’enzima corrispondente ha flusso e gli altri due enzimi hanno flusso zero., Ci sono piccole differenze sulla biomassa nei tre sottotipi. In confronto, il flusso di biomassa e la fissazione di CO2 sono massimi nel sottotipo PCK. Inoltre, quando si presume che tutti e tre i sottotipi siano attivi in un sistema metabolico, il sottotipo PCK è superiore per essere utilizzato per la decarbossilazione di CO2. Questi risultati sono coerenti con gli esperimenti di Fravolini che le prestazioni fotosintetiche e la produzione di biomassa fuori terra di B. curtipendula, (sottotipo PCK) sono maggiori dei tipi NADP-ME e NAD-ME ., Tuttavia, la fotosintesi e la biomassa di diversi sottotipi dipendono anche dalle condizioni ambientali, tra cui l’approvvigionamento di acqua e azoto . Ad esempio, alcune specie di tipo NADP-ME mostrano tassi più elevati di fotosintesi e produzione di biomassa a bassa disponibilità di azoto . Pertanto, per chiarire chiaramente la superiorità dei sottotipi C4, sono necessari ulteriori progetti e analisi in combinazione multifattoriale di condizioni ambientali.,