3.1.2.2. HPLC
HPLC acetonitril – vagy hexán-alapú mobil fázisokkal lehetővé teszi a foszfolipidek közvetlen kimutatását a nyerskivonat előzetes tisztítása nélkül, így ezek a módszerek egyszerűek és gyorsak. Ezek a módszerek azonban nem különítik el hatékonyan a különböző inozitol-foszfolipideket. Nakamura et al. (1989) kifejlesztettek egy HPLC eljárást, amely kifejezetten elemzi a Ptdineket és a PtdInsP2-t az agyban., Ebben a módszerben a lipidkivonatot először 9-antrildiazometánnal származtatják (9-antril) PtdInsP és di(9-antril) PtdInsP2 előállításához, majd a származtatott mintát HPLC választja el 245 nm-es UV detektálással. A PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn és SM nem származtatott ezzel a reagenssel, ezért nem zavarják a vizsgálatot (Yamada et al., 1988). Ez a módszer érzékenyebb, mint az inozitol-foszfolipidek elemzésére szolgáló underivatized UV detektálási módszer.
Low (1990) leírta a DEAE cellulóz oszlopok alkalmazását az agyi lipidek preparatív HPLC-jére., Az agy foszfolipidek feloldjuk 50 ml oldószer a (kloroform/metanol / H2O, 20:9: 1, vol.) és a cellulózoszlopra (DEAE cellulóz, Sigma) alkalmazzák, amelyet lúgokkal és savval semlegesre mosnak. A mosott DEAE cellulóz egy üvegoszlopba (2 cm × 38 cm) van csomagolva oldószerálló szerelvényekkel. Az oszlopot ezután 100 ml/h áramlási sebességgel eluáljuk 1 1 lineáris gradienssel, 100% A-tól 100% – ig terjedő oldószer B-ig (0,6 M ammónium-acetátot tartalmazó a oldószer) és 13-15 ml frakciókat gyűjtünk össze, majd foszforra vizsgáljuk (1.ábra). 3.3).,
ábra. 3.3. A szarvasmarhák agyából származó Ptdinsp-k izolálása DEAE-cellulóz oszlopkromatográfiával. A savval mosott metanol-kicsapódott Folch frakciót DEAE-cellulóz oszlopból eluáltuk 100% a oldószer gradiensével (kloroform/mefhanol/H2O, 20:9:1, térfogatban.) 100% B oldószerhez(a oldószer 0,6 M ammónium-acetátot tartalmaz) és 13-15 ml frakcióhoz. A frakciókat szerves foszforra vizsgálták. Az alkalmazott szerves foszfor átlagos visszanyerése körülbelül 90% volt., A csúcs eluálás frakciószám. Huszonöt volt reprodukálható jelen, de nem azonosították. A csúcsok összetételét az összevont frakciók TLC-elemzése határozta meg. A csúcsokat az ábrán látható módon azonosítják.
reprodukálni alacsony (1990) engedélyével kiadó.
Alternatív megoldásként Low (1990) a kromatográfiás lépést preparatív HPLC-vel hajtotta végre egy amino oszlop segítségével. Az agy foszfolipidjeit 5 ml a oldószerben oldottuk, és 2-es áramlási sebességgel alkalmaztuk.,5 ml/min 10 mm × 250 mm amino-NP oszlop (5 µm, gömb alakú szilícium-n-propylamine kötött fázis, az IBM-Eszközök, Danbury, CT) 4.5 mm × 50 mm őr oszlop az idők folyamán egyensúlyba kerül Oldószerrel A. Az oszlop eluálódnak áramlási sebességgel 2,5 ml/min 25 ml Oldószer Egy 125 ml-es gradiens 100% Oldószer Egy 100% Oldószer B, illetve 100 ml 100% – os Oldószer B; 5 ml-es frakciók gyűjtését. Az összevont frakciókat úgy koncentráljuk, hogy az a oldószerrel 18 ml-re állítjuk be, és kivesszük a foszfolipideket. A szerves foszfor átlagos visszanyerése 80%., A Ptdinek (90 ml), PtdInsP (150 ml) és PtdInsP2 (160-200 ml) teljes szétválasztását (kromatogram nem látható) kaptuk. A Ptdinek azonban átfedésben vannak a Ptdserrel. A csúcsok összetételét az összevont frakciók TLC-jével határoztuk meg.
Low (1990) a jelzett Ptdinek(4)p és Ptdinek(4,5)P2 humán vérlemezkékből történő HPLC-tisztítását is leírta. A vérlemezkék lipidkivonatát 60 ml friss emberi vérből állítottuk elő metanol jelenlétében kicsapódott szarvasmarha-agy PtdInsPs hordozóként, végül 0-ban oldjuk fel újra.,5 1 Oldószer, illetve az alkalmazott áramlási sebesség 1 ml/perc 4,5 mm × 250 mm amino-NP oszlop az idők folyamán egyensúlyba kerül az Oldószer A. Az oszlop eluálódnak 5 ml Oldószer Egy (egy 25 ml-es lineáris gradiens a 100% Oldószer Egy 100% Oldószer B), majd 20 ml Oldószer B., Egy milliliter frakciók gyűjtik, radioaktivitás által meghatározott folyadékszcintillációs módszer. Az alkalmazott radioaktivitás átlagos visszanyerése körülbelül 70%. A három inozitol-foszfatid kiváló felbontása van, de a Ptdinek átfedésben vannak a PtdOH-val., Ezért ez a HPLC eljárás nem alkalmas Ptdinek előállítására, mivel a PtdOH, amely a legtöbb sejttípusban gyorsabban fel van tüntetve a Pi-vel, nem oldódik meg belőle. Valószínű, hogy más anionos foszfolipidek, például a PtdSer az amino-NP oszlopban rosszul oldódnak meg a Ptdinektől, amint azt a DEAE-cellulóz eljárás során megfigyelték.
amint azt a fentiekben tárgyaltuk, a fenti módszerek egyike sem képes hatékonyan elválasztani az egyes Ptdinsp-ket tiszta formában a nyers szövetkivonatoktól. Ezért a lipidkivonatokat több kromatográfiás lépéssel kell feldolgozni., Ebből a célból a kivonatot először Sephadex kromatográfiának vetik alá a lipidek elválasztására a kivonatban lévő nemlipidektől. A lipidfrakciót ezután egy DEAE oszlopra öntjük, amelyet különböző oldószerekkel eluálnak. A Ptdinsp-ket a végső elúciós lépésként kloroform/metanol/ammónium-sóval történő elúcióval nyerik vissza. Az egyes frakciók koncentrálódnak 100 µl 45°C alatt nitrogén majd a koncentrált maradvány további elválasztott patron-kromatográfiás oszlop, TLC, HPLC vagy más kromatográfiás eljárások.,
Singh(1992)leírta a Ptdinek, Ptdinek(4)P és Ptdinek (4,5) P2 kivonását és elemzését egy Sep-Pak patron segítségével. Teljes lipidkivonat (Folch et al., 1957) először patkányagy szinaptoszómákat és mikrovesszeleket állítottak elő, majd az első keletkezett frakciót (1. frakció) összegyűjtötték és további extrahálták a Dugan et al. által leírt foszfolipidek és glikolipidek szétválasztására. (1986). A foszfolipid frakciót DEAE-cellulóz-kromatográfiának (4.elválasztási szekvencia) vetették alá, amint azt Rouser et al. (1969) az inozitol lipidek további tisztítására., A tisztított kivonatot átvisszük egy Sep-Pak patronba. Az oszlopból különböző inozitol-lipideket állítanak elő ammónium-acetát és víz lineáris gradiensével: 0,5% ammónium-acetát (200 mM) és 99,5% víz az ammónium-acetát 75% – ára és 25% víz 60 perc alatt, 0,5 ml/perc áramlási sebesség mellett (lásd a 2.fejezetet). Az eluate oszlopot 120 percig 1 ml frakciókban gyűjtöttük össze. Különböző csúcsokat azonosítottak a Ptdinek, a Ptdinek(4)P és a Ptdinek(4,5)P2 csúcsok referenciapontként való felhasználásával., Az egyes inozitol lipideket tartalmazó frakciókat a HPLC egyesítette és elemezte a Geurts van Kessel et al. (1977). Az egyes foszfolipideket 206 nm-en detektálták egy 200-350 nm-es tartomány beolvasására programozott dióda tömb detektor segítségével. Singh (1992) 50-90% – ban igazolta a Ptdinek és az Insp-k visszanyerését az agymintákból. Az InsP3 és az InsP4 esetében a gyenge számszerűsítés, nem pedig a gyenge kitermelési módszer miatt volt a legalacsonyabb a fellendülés. A patron módszereit nem alkalmazták a Ptdinek(3)p, Ptdinek(3,4)P2 és Ptdinek (3,4,5)P3 izolálására.
Cronholm et al., (1992) leírták a ptdinsps izolálását patkány hasnyálmirigyből. Minden hasnyálmirigyet azonnal homogenizáltak 3 ml kloroform / metanolban(1:2, v / v), és körülbelül 3 MBq 3H-címkével ellátott Ptdineket(4)p vagy Ptdineket(4,5) P2 adtak hozzá 0,6 ml 1,2 aq-val együtt. HCl a kloroformmal történő extrahálás előtt, a Schacht által leírtak szerint (1981). Az összevont és mosott kivonatokhoz metanolt adtak, hogy kloroform/metanol (3:2, v/v) keletkezzen. Az oldatot felvittük a Lipidex-DEAE oszlopra, és a lipidek nagy részét kloroform/metanollal (3:2, v/v) vagy kloroform/metanollal/vízzel (3:6:1 térfogatban.)., A ptdineket és a Ptdsert 0,03 M H3PO4-gyel és 0,1 M H3PO4-gyel azonosítatlan anyaggal együtt eluálták. A PtdIns(4)P-t 0,25 M H3PO4-gyel, a PtdIns(4,5) P2-t pedig 0,5 M H3PO4-gyel eluálták, amint azt az eluált radioaktivitás jelzi. Az összes frakciót 0,4 ml vízzel/ml eluátummal extraháltuk. A felső fázist 0,1 vol-val visszavonták. kloroformból. Az összevont kloroform fázisokat 0,4 vol-val mostuk. 0,5 M HCl 50% aq-ban. metanol. A frakciókat a molekuláris Fajok FAB / MS által történő meghatározására használták (lásd alább).
Gunnarsson et al., (1997) használt normál fázisú HPLC párolgási fény szórás kimutatására elemzésére kereskedelmi minták PtdInsPs együtt más foszfolipidek. Egy lineáris gradiens a, kloroform/metanol/ammónia (50:45:3, vol.) és B, kloroform / metanol / víz / ammónia (25:55:17:3, vol.)a Ptdinek(4)p és Ptdinek(4,5) P2 jól oldott késői csúcsai. A PtdIns(4)P és PtdIns(4,5)P2 dózisreakciós görbék nem voltak lineárisak, ami a szórásérzékelőre jellemző (az eredmények nem láthatók)., A legtöbb esetben a HPLC technika jobb felbontásban, gyorsaságban és az Általános kényelemben, mint a DEAE-cellulóz eljárás, és a választás módja, ha HPLC berendezés áll rendelkezésre. A DEAE-cellulóz olcsó, és nagy léptékű tisztításhoz szükség lehet ennek az anyagnak a felhasználására. A HPLC-eljárás bizonyos vagy minden tekintetben felülmúlja a polifoszfoinozitidek tisztítására szolgáló alternatív eljárásokat, például preparatív TLC vagy neomicin affinitás kromatográfiát.