megfigyelés
A mikrobiológia fejlődésének nagy része a “tiszta kultúrák” vizsgálatától függött.”Ezek olyan kultúrák, amelyek csak egy típusú sejtet tartalmaznak, ideális esetben egy kezdeti egyetlen sejtből származó kultúrával., A tiszta kultúrák létrehozására szolgáló módszerek (1) korai kifejlesztésétől kezdve számos példa volt arra, hogy az eredetileg tisztának tekintett kultúrákat később kétféle mikrobát tartalmaztak. Bizonyos esetekben ezek a véletlen többfajú kultúrák fontos áttörésekhez vezettek, például a fajok közötti hidrogénátvitel felfedezéséhez (2). A mély szekvenálási technológiák megjelenésével azonban ésszerűen megjósolható, hogy a kultúrákban nem észlelt szennyeződések már nem jelentenek jelentős aggodalmat.,
A Geobacter sulfurreducens PCA törzset az 1990-es évek közepén izolálták olyan standard dúsítási és izolációs technikák alkalmazásával, amelyek folyékony közegben a kihalásig való hígítást tartalmazták, majd az izolált kolóniák agar-megszilárdult közegben történő ismételt csíkozását (3). Ez a klasszikus stratégia, amelyet a legnépszerűbb bevezető mikrobiológiai tankönyvekben tanítanak (4-6). Később a G. sulfurreducens DL1 törzset izolált PCA kolóniák (7) további helyreállításával nyerték. A G. sulfurreducens (7) genetikai manipulációjára és genomjának szekvenálására szolgáló módszerek kifejlesztésével (8), G., a sulfurreducens lett a geobacter faj, amely ennek a környezetileg fontos nemzetségnek a fiziológiájának és új extracelluláris elektronátviteli tulajdonságainak tanulmányozására választott (9). A tenyészetben lévő 16S rRNA gén kezdeti szekvenálása (3), valamint a genom szekvenálása először 8-szorosára (8), majd 80-szorosára (10, 11), azt jelezte, hogy a tenyészet csak egy törzset tartalmazott.,
annak érdekében, hogy a DL1 adaptív módon fejlődjön, hogy több áramot termeljen, bioelektromos rendszerbe oltották be, grafit anóddal, amely potenciális (-400 mV versus Ag/AgCl), amely közel áll az alsó határhoz, amelyen az acetát jelenlegi generálása lehetséges (12). Az anód biofilmből nyert izolátum, G., a KN400 (12) szulfurreducens törzs felülmúlja az inokulum törzset az elektromos áram előállításában, és ezt a fölényt legalább részben annak a képességének tulajdonítják, hogy több “mikrobiális nanorészecskét” termel, elektromosan vezető fehérjeszálakat, amelyek fémszerű elektromos vezetőképességet mutatnak (13, 14).
kezdetben azt feltételezték, hogy a KN400 törzs egy vagy több mutációt halmozott fel, amelyek fokozták az extracelluláris elektronátvitel kapacitását., Ez hasonló lenne a mutáns törzsek kiválasztásához a DL1 törzs adaptív evolúciója során más organizmusokkal (11) történő elektroncserére vagy az Fe(III) – oxid csökkentés (10) magasabb arányára. Az összehasonlító genomika azonban kimutatta, hogy a KN400 törzs genomszekvenciája több mint 27 270 egyetlen nukleotid polimorfizmust (SNPs) tartalmazott (15). A gének egyharmadában legalább egy nukleotid polimorfizmus volt, negyedében pedig polimorfizmus volt, amely befolyásolta a kapott fehérje szekvenciát (15). A tipikus mutációs arányok alapján 6.,3 × 10-9/bp generációnként (16), több mint 1000 évbe telik, hogy felhalmozódjon ez a sok mutáció a DL1 törzsben. Ezenkívül a KN400 törzs genomjában a nyílt olvasószervek (ORFs) 139 esetében nincsenek ortológok a DL1 törzsben, amelyek többsége szorosan kapcsolódik a filogenetikailag különböző organizmusok génjeihez (15).
Ezek a megfontolások és az a tény, hogy a KN400-ra jellemző ORF-eket nem észlelték, amikor az inokulumkultúrát újrakeverték (10, 11), azt a hipotézist eredményezte, hogy a KN400 szennyezőanyagként lépett be a bioelektrokémiai rendszerbe., Ennek a lehetőségnek a kiértékeléséhez a DL1 kultúra tisztaságát még nagyobb érzékenységgel tovább értékelték.
mind a DL1, mind a KN400 OMC-kat tartalmaz, egy olyan külső felületi citokróm génjét, amely a két törzs között az egyik legnagyobb arányban (36 SNPs/kb) rendelkezik SNP-vel (15). Ezt a gént a bioelektrokémiai rendszer beoltására használt DL1-tenyészetből erősítették, a PCR-termékeket pedig Illumina Hi-Seq 2000-rel szekvenálták (lásd Az S1 szöveget a kiegészítő anyagban)., A KN400 szekvenciát detektáltuk, jelezve, hogy a KN400 jelen volt az anódkiválasztási vizsgálathoz használt kezdeti inokulumban. A>107 kiváló minőségű szekvencia közül azonban csak 286 KN400 szekvencia volt, szemben az 1,5 × 107 DL1 szekvenciákkal (1.táblázat).
szöveg S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk elosztott értelmében a Creative Commons Attribution-Kereskedelmi-ShareAlike 3.0 Unported licenc, amely lehetővé teszi korlátlan nem üzleti célra használja, engedély, valamint sokszorosítása, bármilyen közepes, feltéve, hogy az eredeti szerző, forrás vagy jóváírásra.,
- Nézet inline
- Nézet popup
Becslések törzs KN400 rengeteg különböző culturesa
Táblázat S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3 feltételei szerint terjesztenek.,0 Unported license, amely lehetővé teszi korlátlan nem kereskedelmi használatra, Terjesztés, reprodukció bármely médium, feltéve, hogy az eredeti szerző, forrás jóváírásra kerül.
A relatív abundancia a KN400 törzs ugyanezt a kultúra további értékelte mennyiségi PCR (qPCR) a primer meghatározott specifikus gént találtak, csak KN400 (lásd a Szöveget S1, valamint Táblázat S1 a kiegészítő anyag), valamint a primer beállítani, hogy az észlelt, mind KN400, valamint DL1 (lásd a Táblázatot S1 a kiegészítő anyag)., A KN400-specifikus szekvencia relatív bősége hasonló volt a szekvenálási megközelítéssel meghatározott KN400 omcS szekvenciákéhoz (1.táblázat). Az ATCC-ben lerakódott PCA-kultúra szekvenciaelemzése és qPCR-vizsgálata kimutatta a KN400 jelenlétét hasonló alacsony bőség mellett (1.táblázat).
megpróbáltuk eltávolítani a ritka KN400 szennyeződést a DL1 tenyészetből a megszilárdult acetát-fumarát táptalajon (7) termesztett izolált telepek ismételt újratelepítésével, de a KN400 törzs továbbra is alacsony gyakorisággal fennmaradt az izolált kolóniákban (1.táblázat)., Olyan tenyészetet azonban, amelyben KN400-at Már nem lehetett kimutatni, folyékony acetát-fumarát közegben (lásd Az S1 szöveget a kiegészítő anyagban), amelyben a legnagyobb növekedést mutató hígítást több egymást követő sorozathígításnak vetették alá (1.táblázat). Ez azt mutatta, hogy a DL1 törzs nem igényli a KN400 ritka jelenlétét annak érdekében, hogy az acetát-fumarát közegben növekedjen, amelyen ezt a kultúrát rutinszerűen fenntartják.
amikor a tiszta KN400-at és a KN400-mentes DL1-tenyészetet egyenlő mennyiségben acetát-fumarát közegbe oltották be, a DL1-et KN400-ra (1.ábra)., 1a). Ez összhangban van azzal a megállapítással, hogy amikor a két törzsek voltak, felnőtt külön-külön, DL1, sokkal gyorsabban nőtt, mint KN400 (optikai sűrűsége 600 nm-0, 04 a KN400 ellen 0.65 a DL1 után 36 h a lappangási; ld. S2 a kiegészítő anyagban) ugyanabban a közegben. A KN400 aránya az egymást követő transzferekkel (1% – os inokulum) tovább csökkent, amíg a KN400 mennyisége nem volt összehasonlítható a PCA és a DL1 tenyészetek mennyiségével (lásd Az S1 szöveget a kiegészítő anyagban). KN400 kitartott ezen az alacsony szinten további transzferek (ábra. 1a).,
S2
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk elosztott értelmében a Creative Commons Attribution-Kereskedelmi-ShareAlike 3.0 Unported licenc, amely lehetővé teszi korlátlan nem üzleti célra használja, engedély, valamint sokszorosítása, bármilyen közepes, feltéve, hogy az eredeti szerző, forrás vagy jóváírásra.,
A KN400 törzs növekedése és aktivitása különböző növekedési körülmények között. a) A kn400 és a DL1 azonos arányú tenyészet egymást követő középlog-transzfereiben (1% – os inokulum) a KN400 relatív bősége. Az eredmények a hármas kultúrák eszközei és szórása. b) A jelenlegi termelés, amikor a DL1-kultúrát bevitték egy bioelektrokémiai rendszer anódkamrájába -400 mV-on poised grafit anóddal, szemben az Ag/AgCl-rel. A KN400-mentes kultúra nem termelt áram ebben az időben., c) A KN400 relatív bősége az anód biofilmekben, amikor a kezdeti inokulum a DL1 kultúra volt, amelyről később kiderült, hogy KN400-at is tartalmaz. Az eredmények a hármas kultúrák eszközei és szórása.
a KN400-mentes DL1-kultúra -400 mV-nál poised anódon történő termesztésére irányuló ismételt kísérletek sikertelenek voltak. Az áramot azonban könnyen előállították egy másik kísérletsorozatban, amelyben a KN400-at tartalmazó DL1 kultúra szolgált inokulumként (ábra. 1b)., Az anód biofilmből kivont DNS qPCR vizsgálata azt mutatta, hogy az omcS szekvenciák 100% – a KN400 volt a második átvitelen belül (ábra. 1c). Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a KN400 az anódokon azért alakult ki, mert a DL1 törzs nem tudott növekedni az előírt feltételek mellett. E szokatlan szelektív nyomás nélkül a KN400 észrevétlen maradt volna a PCA és DL1 kultúrákban, még a jelenleg rendelkezésre álló következő generációs szekvenálási módszerekkel is, amelyek elméletileg ezerszeres lefedettséget biztosíthatnak a genomszekvenálásban.,
a KN400 törzs hosszú távú fennmaradásához hozzájáruló tényezők rendkívül alacsony frekvencián a DL1 kultúrában továbbra is rejtély maradnak. Annak fontosságát, hogy fizikailag leválasztó egyes sejtek által módszerek végleges több, mint száguld a szilárd közeg megállapítani, tiszta kultúrában már ismert egy ideje (17), valamint az egyre kifinomultabb módszerek megvalósítására, ez továbbra is a fejlett (18-23)., A leggyakoribb azonban azok a galvanizálási módszerek, amelyeket több mint 100 éve használnak, és minden mikrobiológiai hallgatónak tanítják, mint a tiszta kultúrák megszerzésének standard eljárásait (4-6). Az itt bemutatott eredmények bizonyítják, hogy anélkül, egysejtű, elszigeteltség, rejtélyes szennyező lehet túlélni a nagyon alacsony frekvenciájú kultúrák évtizedes intenzív vizsgálat menekülni felismerés által még a legkifinomultabb szekvenálási módszerek jelenleg elérhető.,
S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk elosztott értelmében a Creative Commons Attribution-Kereskedelmi-ShareAlike 3.0 Unported licenc, amely lehetővé teszi korlátlan nem üzleti célra használja, engedély, valamint sokszorosítása, bármilyen közepes, feltéve, hogy az eredeti szerző, forrás vagy jóváírásra.,