Bevezető
Ambergris, egy ismert természetes termék, az ámbráscet , az is kiderült, hogy maradványokkal a strandok világszerte , pedig már nagyon értékesek a segédprogram a parfüm iparban . Bár régóta úgy tartják , hogy a Jetsam ambergris gyűjtött strandok származik ámbráscetek, kevés vagy semmilyen bizonyíték erre még soha nem tették közzé, és különbségek vannak az ilyen minták és minták ambergris közvetlenül vett ámbráscet., Például a jetsam ambergris minták általában sokkal nagyobb arányban tartalmaznak triterpenoid alkoholt ambrein és sokkal kisebb arányban szterolokat, mint az ámbráscetekből származó ambergris minták. Ezzel szemben a jetsam ambergris néha tartalmaz tintahal csőrdarabokat , és mivel a lábasfejűek, mint például a tintahal, képezik a spermabálnák fő étrendi összetevőjét, ezt a Jetsam coproliths spermabálnákból származó eredetének bizonyítékaként említik. Azt is feltételezik, hogy az ambergris a kemény tintahal csőr kitin irritálásából származó kóros szekrécióból származhat ., Ugyanakkor más tengeri emlősfajok (például a Globicephala és a Ziphiidae tagjai) is megelőzik a tintahalat , és némelyikük (beleértve a törpe és a törpe ámbráscetet is) szintén az ambergris potenciális forrásaként szerepel . Ezért, hogy a további tisztázására, a származási maradványokkal ambergris, mi elemzésre DNS-ét egy ambergris mintát gyűjtött egy ámbráscet partra vetett, hogy Hollandiában, szemben a DNS-szekvenciák izolált maradványokkal ambergris gyűjtött strandok-Új-Zélandi Sri Lanka.,
az Ambergris túlnyomórészt ambreinből áll, mivel sok szervezetben a szkvalénből, a közös metabolikus termékből származik . Ezt a folyamatot a bél mikrobiális hatása indukálhatja, és sűrű, szilárd tömegekben kicsapódik a bálna vastagbélben . Az eredményül kapott koprolitikus felhalmozódások kompozit módon jól alkalmazhatók a vastagbél DNS-ének megőrzésére, mivel az ambrein hidrofób, és látszólag ellenáll a savas enteriőr környezeten belüli lebomlásnak., Bizonyíték a radiokarbon minden bizonnyal azt jelenti, ellenállás mikrobiális, fotó-bomlás a tengeri környezet akár egy millenniumi néhány maradványokkal ambergris minták . Feltételeztük, hogy az ilyen anyag megfelelő gyorsítótárat biztosíthat a DNS megőrzéséhez, még akkor is, ha hosszabb ideig káros körülmények között van a tengeren.
anyagot és módszereket
Jetsam ambergris példányokat elemeztek az Északi-tengerről, az Indiai-óceánról és a Csendes-óceánról, amelyek az anyag globális eloszlását képviselik ., Három jetsam ambergris-példányt (egy Srí Lankáról, kettő az Új-zélandi Pitt-szigetről) DNS-extrakció céljából alcsoportba soroltak. A negyedik példány egy 2012 decemberében partra vetett hím ámbráscet boncolásából származik, a hollandiai Texel közelében fekvő Razende Bol-ban. Az utóbbi “friss” ambergris, egy megerősített ámbráscet hasított testből, ismert összehasonlítást nyújtott a meg nem erősített biológiai előzményekkel rendelkező jetsam példányokkal. Az ambergris mintáit a korábbi vizsgálatok során ambrein és széklet szterin-tartalom alapján állították elő és elemezték.,
DNS-extrakciót és szekvenálást végeztek a Koppenhágai Egyetem GLOBE Intézetében, egy dedikált ősi DNS laboratóriumban, a szennyeződés minimalizálására vonatkozó szigorú eljárásokat követve. Körülbelül 120 mg-ot szubszampláltak (1.ábra és 1. táblázat) a DNS-extrakcióhoz. A mintákat Gilbert et al után 400 µl proteináz k-tartalmú pufferben inkubáltuk. 56°C-on 10 órán keresztül; a szupernatánsokat ezután fenol-kloroform lépéssel kezelték Carøe et al., a Monarch DNA Cleanup oszlopokkal (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) megtisztítva a gyártó iránymutatásai szerint. A kettős szálú könyvtárak DNS-kivonatokból épültek a legjobb protokoll szerint, amelyeket kifejezetten az ősi és lebontott DNS szekvenálására terveztek és bizonyítottak. A könyvtárakat a pfuturbo CX Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) segítségével PCR-n keresztül erősítették és indexelték a gyártó irányelvei szerint., Termékek összevonták a equimolar koncentráció, mielőtt szekvenálás egy Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA) platform használatával 80 bp egyetlen végén kémiát, a dán Nemzeti Nagy áteresztőképességű DNS Szekvenálás Központ, Koppenhága, Dánia.
1.ábra. Részletek az elemzett ambergris mintákról. (a) térkép, amely bemutatja azokat a helységeket, ahol az ambergris mintákat eredetileg találták., (b) ábrázoló Fényképeket nagy változatossága a fizikai jellemzők ambergris töredékek: TEXEL151212 (a tagolt bálna példány) szemcsés volt a következetesség, míg maradványokkal minták felületesen megjelent több, sűrű, heterogén, illetve belső equigranular pedig lényegesen halványabb színű.
| minta | hely | teljes Tömeg (g) | elemzett tömeg (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| Pitt-sziget, Új-Zéland | 50 | 96 | 92 | |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | Nyugat-Srí Lanka | 101 | 188 | 60 | texel151212 | Texel, Hollandia | 83000 | 92 | 93 |
| minta | teljes megtartott olvassa | átlagos megtartott olvasni hossz (bp) | teljes igazítva olvas (mtDNA) | szer lefedettség (mtDNA) | teljes igazítva olvas (egész genom) | szer lefedettség (egész genom) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72,9 | 43 | 0,175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71,7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62,6 | 71 190 | 19,654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
szekvencia elemzést végeztek a Koppenhágai Egyetem nagy teljesítményű számítástechnikai létesítményében, a PALEOMIX csővezetékkel feldolgozott FASTQ fájlokkal (v. 1.2.13) . A fastqc V. 0.11.8-at eredetileg a nyers szekvenciaadatok minőségellenőrzésére használták. Adapterek vágták AdapterRemoval v. 2.3.1, A olvasás kevesebb, mint 25 bp is eltávolították. Olvasás ezután leképezték referencia szekvenciák segítségével BWA, is alkalmazása mapDamage2.,0 az alapvető degradációs számszerűsítéshez, nyomvonalakat hozva létre referenciaszekvenciákkal. Az ANGSD-t ezután szekvenciák előállítására használták FASTA formátumban.
az ambergris termelésének eredetével és biológiai mechanizmusaival kapcsolatos bizonytalanság arra késztetett bennünket, hogy több lehetséges cetfajt és pinniped fajt is megvizsgáljunk a szekvenciaanalízis során. A fajok azonosságát az NCBI RefSeq 19 cetfélével és pinniped tagjelölt fajjal való sikeres és filogenetikai kapcsolat feltérképezése (lásd az elektronikus kiegészítő anyagot) eredményezte., Ezeket a fajokat a lehetséges alkalmasság alapján választották ki, mint mély búvárkodó tengeri emlősök, amelyek hasonló ökológiai rést töltenek be a spermium bálnákhoz, hogy kizárják, hogy az ilyen fajokat az ambergris előállításához társítják. A mintaszekvenciákat a MAFFT v. 7.392-gyel konkatenálták és igazították . A filogenetikai fa modelleket ezután MEGA X-ben állították elő a legnagyobb valószínűségű módszerrel A Hasegawa-Kishino-Yano modellel, a maximális kompozit valószínűségi megközelítéssel becsült távolságokkal (az összes felhasznált referenciaszekvenciát az elektronikus Kiegészítő anyag tartalmazza).,
eredmények
a filogenetikai elemzések egyértelműen alátámasztották a négy ambergris minta spermabálna eredetét (2.ábra; elektronikus Kiegészítő anyag, S1 ábra). Hasonlóképpen, az NCBI (NC_002503.2) Physeter macrocephalus mitokondriális referencia-genomjával való összehangolás a legmagasabb lefedettségi eredményeket hozta az összes elvégzett nyomvonal mintájára, és magabiztos hozzárendelést biztosít, bár a minták közötti siker jelentős változásaival. A minta szekvenálása egy szálú spermabálnából (TEXEL151212), amelyet messze a legmagasabb lefedettség (kb., 20×) spermabálna mitokondrion esetében, míg a Pitt-sziget egyik jetsam mintája (S. 01) csak körülbelül 0,2× lefedettséget eredményezett (lásd a 2.táblázatot). A kogia sima (törpe ámbráscet) és a kogia breviceps (pygmy spermabálna) referencia mitokondriális genomokkal (NC_041303.1, NC_005272.1) való összehangolása szintén lefedettséget eredményezett (részletek az elektronikus kiegészítő anyagban), bár sok erősen konzervált funkcionális régió megosztott az elemzett Fajok között, ami nagy szekvencia-hasonlóságot eredményez . Azonban, lefedettség kogiid Fajok jellemzően körülbelül egy tényező 10 kevesebb, mint a Physeter., A P. macrocephalus teljes nukleáris referencia genomjával (ASM283717v2) való összehangolás szintén sikeres volt, bár ez jobban látható a genomhoz leképezett összes olvasás összehasonlításában. Az Archeuthis dux (óriás tintahal), a spermabálnák híres közös zsákmánya (pl.) összehangolása sikertelen volt, de ez nem az elsődleges zsákmányuk .
2.ábra. A legnagyobb valószínűségű filogenetikai fa modell referenciaszekvenciákból és igazított mitokondriális genomokból származik., A minták egyértelműen spermabálnával (P. macrocephalus) csoportosulnak, nem pedig törpe és törpe ámbráscetekkel (Kogia spp.). Ez a fa tükrözi a legmagasabb log-annak valószínűségét, modell, értékek tükrözik a százalékos fák számítani, amelyben a hozzá tartozó taxonok volt fürtözött, jelezve, bizalmat elhelyezése, valamint a fióktelep hosszúságú intézkedés száma cserék mindkét oldalon (lásd a skála). Ábra előállított MEGA X . Bálna ábrázolások: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.szvg., A filogenetikai fa, amely mind a 19 jelölt fajt tartalmazza, elektronikus kiegészítő anyagban, Az S1 ábrán látható.
Eredményei MapDamage mutatják, rendkívül kis inter-minta változása befolyásoló C-T átmenetek a 5′ fonal végén, de nagyobb százalékban G, hogy Egy átmenet a 3′ vég létezik S. 01 (részletek az elektronikus kiegészítő anyag, ábra S2), jelezve a lehetséges magasabb biomolecular lebomlás., Általában azonban nagyon kevés kémiai módosítás történt, és a változások eloszlása a szálak között egyenletes és lapos marad.
Vita
Ez a tanulmány kimutatta, hogy három jetsam ambergris minta magabiztosan tulajdonítható a spermium bálnának DNS-extrakcióval. Míg visszaigazolást egy ámbráscet származási maradványokkal ambergris nem meglepő eredmény, hogy a jelen tanulmány az első, amely jelentős proof-of-concept visszakeresésére endogén DNS-ambergris sikeresen használja a szervezet azonosítása., Fontos, hogy az itt vizsgált mindhárom jetsam ambergris minta eredete magabiztosan azonosítható spermium bálnaként nemcsak a genetikai igazítás sikere alapján, hanem a mitokondriális genomok modellezése a filogenetikai rokonsági fákban is, beleértve az outgroup tengeri emlős taxonok nagy mintáját., Bár az itt elemzett összes mintát spermabálnából származóként azonosították, továbbra is valószínű, hogy más, szorosan kapcsolódó mélytengeri tengeri emlősök (például a törpe és a törpe ámbráscetek) ambergrist termelhetnek, és ezt eddig egyszerűen még nem rögzítették.
a minták közötti genetikai lefedettség drámai változásának domináns oka nem tisztázott. A DNS lebomlásának elemzése a térképben2.,A 0 kevés korrelációt mutat az igazítási burkolatokkal, ahogy az várható volt, és a mintákban az ambrein-tartalom között is kevés olyan eltérés van, amely várhatóan hozzájárul a DNS-mentességhez. A pontos kor a jelen jetsam minták ismeretlen, bár a korábbi vizsgálatok sikeresen radiokarbon kelt más ambergris minták . Azonban, radiokarbon társkereső viszonylag friss minták problematikus hatása miatt a fosszilis tüzelőanyagok kibocsátása, és radiokarbon dátumokat, mivel a növekedés az antropikus szén kibocsátás megbízhatatlanok., Termelő következetes lebomlási sebesség G egy átmenetek megbízhatóan kelt régebbi minták lehet, a jövőben, támogatás jobb megértése differenciál DNS-károsodás. Egy másik lehetőség a jövőbeli kutatások lehetnek tanulmányok glutamin deamidation és aszparaginsav racemization elemzéséből származó szerves peptidek esetleg szintén jelen van ambergris . Alternatív megoldásként azonban a DNS és az ambrein koncentrációjának a mintán belüli változása ugyanolyan valószínű, hogy az S mintában alacsony lefedettséget eredményez.,01, míg a közelmúltban a spermium bálna szövetének való kitettség kétségtelenül a texel151212 fehérített bálna minta Magas lefedettségét jelenti.
az ambrein DNS-ben kicsapódó tartósítási potenciálja nemcsak az endogén bálna genetikájára terjed ki, hanem a bálna bél mikrobiómájának metagenomikus lefedettségére, valamint potenciálisan zsákmányuk DNS-ére is. Például a DNS a spermabálna ürülékében található részlegesen vagy el nem emésztett tintahalcsőrökben , valamint az ambergrisben is maradhat, amelyek még az ambergris szekréció kóros okaként is feltételezik ., Az ambergris mikrobiomkörnyezet prokarióta összetételének megértése tovább tisztázhatja az ambergris eredetét, különösen a szkvalén ambreinné történő átalakításakor, valamint az a folyamat, amellyel az ambergris úgy tűnik, hogy felhalmozódási rétegekben alakul ki. További elemzések endogén DNS-visszakeresés a maradványokkal ambergris, beleértve a DNS-t is a bálna gyomrába bélflóra-mikroorganizmusok, illetve préda lenne hozam lényegesen nagyobb betekintést ámbráscet ökológia, evolúció, valamint az anyagcserét.,
következtetés
Jetsam ambergris már régóta rejtélyes anyag, amelyet a tizennyolcadik század óta tudományos publikációkban vitatnak meg és elemeznek . Ez a tanulmány az első tudásunk szerint, amely DNS-elemzéssel bemutatja a Jetsam ambergris minták spermabálnák biológiai eredetének végleges megerősítését. Ezen túlmenően azonban a jelen tanulmány megállapítja az ambergris potenciálját, mint az ámbráscetekkel kapcsolatos genetikai adatok új forrását, amelyek idővel jelentős hosszú élettartammal rendelkeznek., A DNS ambreinben fennálló tartósítási körülményeinek és a több tényezőtől eltérő hatásoknak a vizsgálatával még nagyobb megvilágítást kell elérni. A bálnák populációjának múltbeli dinamikájáról és ökológiailag kapcsolódó taxáikról való megértésünk elősegítésének lehetséges következményei azonban mélyek lehetnek. A legrégebbi ismert ambergris belül található pleisztocén betétek jellemző permineralizált tintahal csőr tartalmazó aminosavak endogén tintahal, amely a szerzők tulajdonítani a tartósítási kapacitása a helyi üledék ., Bár nem valószínű, hogy egy ilyen korban (1,75 Ma) megmaradna a DNS, ez a megállapítás az ambergris és az ambrein tartósító szubsztrátként való hatásosságának is tulajdonítható. A korábban félig mitikus vadállatként jellemzett tengeri óriások ökológiájáról és adaptációjáról még sok minden nem ismert, ám az ambergris most egy kicsi, de jelentős kulcsnak bizonyulhat néhány további szempont megértésében.
etika
a DNRF-128 PROTEIOS projekt részeként ebben a vizsgálatban etikailag elemezték az összes mintát., A tanulmányban elemzett négy ambergris–minta közül három (S. 01-S. 03) Az S. J. R. által a korábbi publikációkban vizsgált anyagból (lásd fent) szubszamplifikálódott, amelyet Jetsam ambergrisként nyertek a strandokon (ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 és ACL237-S. 03 minta). A negyedik mintát (TEXEL151212) a Texel151212 ambergris minta alcsoportjaként Dr. A. Oosterbaan kedvesen szolgáltatta a hollandiai Texel-I EcoMare Múzeum nevében, ahol a minta többi részét továbbra is tartják. Hálásak vagyunk a múzeum engedélyét, hogy ezt a mintát.,
adatelérhetőség
szerzői hozzájárulások
versengő érdekek
kijelentjük, hogy nincs versengő érdekünk.
finanszírozás
finanszírozást nyújtott a Dán Nemzeti Kutatási Alapítvány grant PROTEIOS (DNRF128).
R. M. hálás Dr. J. A. Samaniego-nak a genomikai elemzésekkel kapcsolatos tanácsokért, valamint M. McCarthy-nak tanácsokért és megbeszélésekért. Hálásak vagyunk Dr. A. Oosterbaannak (Ecomare Múzeum, Texel) az S. 04 mintáért, valamint az S. 01–S. 03 minták névtelen gyűjtőinek., A szerzők szeretnék elismerni az Illumina data generation Dán Nemzeti nagyteljesítményű szekvenáló Központjának segítségét.
lábjegyzetek
elektronikus Kiegészítő anyag elérhető online: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
A Royal Society közzétette a Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, amely korlátlan felhasználást tesz lehetővé, feltéve, hogy az eredeti szerzőt és forrást jóváírják.