A Föld több millió baktériumfajnak ad otthont, mindegyik egyedi jellemzőkkel rendelkezik. E fajok azonosítása kritikus fontosságú a környezeti minták értékelésében. Az orvosoknak meg kell különböztetniük a különböző bakteriális fajokat a fertőzött betegek diagnosztizálásához.
a baktériumok azonosításához számos technikát lehet alkalmazni, beleértve a morfológia vagy a növekedés mikroszkopikus megfigyelését egy adott adathordozón a kolónia morfológiájának megfigyelésére., Genetikai elemzés, a baktériumok azonosításának másik technikája az utóbbi években népszerűvé vált, részben a 16S riboszomális RNS génszekvenálásának köszönhetően.
a bakteriális riboszóma két alegységből álló fehérje RNS komplex. A 30S alegység, a két alegység közül a kisebb, 16S rRNS-t tartalmaz, amelyet a genomikus DNS-ben található 16S rRNA gén kódol. A 16S rRNA specifikus régiói rendkívül konzerváltak, a riboszóma-összeszerelés alapvető funkciója miatt. Míg más, a működéshez kevésbé kritikus régiók a baktériumfajok között változhatnak., A 16S rRNA változó régiói egyedülálló molekuláris ujjlenyomatokként szolgálhatnak a baktériumfajok számára, lehetővé téve a fenotípusosan azonos törzsek megkülönböztetését.
a gDNA minőségi mintájának megszerzése után megkezdődhet a 16S rRNA kódoló gén PCR-je. PCR egy általánosan használt molekuláris biológiai módszer, amely a ciklusok a denaturáció a kettős szálú DNS-sablon, lágyítás az univerzális primer párok, amelyek erősítik erősen konzervált régiók a gén, a kiterjesztés, a primerek által DNS-polimeráz., Míg egyes primerek a 16S rRNA kódoló gén nagy részét erősítik, mások csak a töredékeit erősítik. A PCR után a termékeket agaróz gél elektroforézissel lehet elemezni. Ha az amplifikáció sikeres volt,a gélnek egyetlen, várható méretű sávot kell tartalmaznia, az alkalmazott primer pártól függően, akár 1500bp-ig, a 16S rRNA gén hozzávetőleges hossza.
tisztítás és szekvenálás után a kapott szekvenciák bekerülhetnek a BLAST adatbázisba, ahol összehasonlíthatók a 16S rRNS szekvenciákkal., Mivel ez az adatbázis a legmagasabb hasonlóság alapján tér vissza, ez lehetővé teszi az érdeklődő baktériumok személyazonosságának megerősítését. Ebben a videóban, akkor megfigyelni 16S rRNA gén szekvenálás, beleértve a PCR, DNS-szekvencia elemzés és szerkesztés, szekvencia összeszerelés és adatbázis keresés.
a mikroorganizmusok kezelése során elengedhetetlen a helyes mikrobiológiai gyakorlat követése, beleértve az aszeptikus technika alkalmazását és a megfelelő személyi védőfelszerelés viselését. Miután elvégezte a mikroorganizmusra vagy az érdeklődésre számot tartó környezeti mintára vonatkozó megfelelő kockázatértékelést, szerezzen be egy tesztkultúrát., Ebben a példában a Bacillus subtilis tiszta tenyészetét használják.
kezdeni, növekszik a mikroorganizmus megfelelő közegben a megfelelő körülmények között. Ebben a példában a Bacillus subtilis 168-at lb húslevesben termesztik egy éjszakán át egy rázó inkubátorban, 200 fordulat / perc sebességgel, 37 Celsius fokon. Ezután használjon kereskedelmi forgalomban kapható készletet a genomikus DNS vagy gDNA izolálására a B. szubtilis éjszakai tenyészet 1, 5 milliliteréből.
az izolált DNS minőségének ellenőrzéséhez először keverje össze az izolált gDNA öt mikroliterét egy mikroliter DNS-gél-betöltő festékkel. Ezután töltse be a mintát egy 0-ra.,8% agaróz gél, amely DNS-festési reagenst tartalmaz, például SYBR safe vagy EtBr. Ezután töltsön be egy kilobáz molekulatömegű szabványt a gélre, majd futtassa az elektroforézist, amíg az elülső festék körülbelül 0,5 centiméterre van a gél aljától. Miután a gél elektroforézis befejeződött, vizualizálja a gélt egy kék fény transzilluminátoron. A gDNA-nak vastag sávként kell megjelennie, 10 kilobázis feletti méretben, minimális elkenődéssel.
ezt követően a gDNA soros hígításához három mikrocentrifuga csövet jelölünk 10x, 100x és 1000x-ként., Ezután pipettával adagoljon 90 mikroliter steril desztillált vizet az egyes csövekbe. Ezután adjunk hozzá 10 mikroliter gDNA oldatot a 10x csőhöz. Pipettázzuk fel és le a teljes mennyiséget, hogy az oldatot alaposan összekeverjük. Ezután távolítsa el az oldat 10 mikroliterét a 10X csőből, majd vigye át ezt a 100X csőbe. Keverje össze az oldatot a korábban leírtak szerint. Végül vigye át az oldat 10 mikroliterét az 100x csőbe, az 1000X csőbe.
a PCR protokoll elindításához olvassza fel a szükséges reagenseket jégen. Ezután készítse elő a PCR master keveréket., Mivel a DNS-polimeráz szobahőmérsékleten aktív, a beállított reakciónak jégen kell történnie. Aliquot 49 mikroliter a mester mix az egyes PCR csövek. Ezután adjunk hozzá egy mikroliter sablont az egyes kísérleti csövekhez, és egy mikroliter steril vizet a negatív kontrollcsőhöz, pipettázzunk fel-le, hogy összekeverjük. Ezután állítsa be a PCR gépet a táblázatban leírt program szerint. Helyezze a csöveket a hőcserélőbe, majd indítsa el a programot.,
miután a program befejeződött, vizsgálja meg a termék minőségét agaróz gél elektroforézissel, amint azt korábban kimutatták. A leírt protokollt használó sikeres reakciónak egyetlen, körülbelül 1, 5 kilobáz sávot kell eredményeznie. Ebben a példában a 100x hígított gDNA-t tartalmazó minta a legmagasabb minőségű terméket eredményezte. Ezután tisztítsa meg a legjobb PCR terméket, ebben az esetben a 100x gDNA-t, kereskedelmi forgalomban kapható készlettel. Most a PCR termék elküldhető szekvenáláshoz.
ebben a példában a PCR terméket előre-hátra alapozókkal szekvenáljuk., Így két adatkészlet keletkezik, amelyek mindegyike DNS-szekvenciát és DNS-kromatogramot tartalmaz: az egyik az elülső alapozóhoz, a másik a fordított alapozóhoz. Először vizsgálja meg az egyes alapozókból előállított kromatogramokat. Az ideális kromatogramnak egyenletesen elosztott csúcsokkal kell rendelkeznie, kevés vagy semmilyen háttérjelekkel.
Ha a kromatogramok kettős csúcsokat mutatnak, több DNS-sablon is jelen lehet A PCR-termékekben, és a szekvenciát el kell dobni. Ha a kromatogramok különböző színű csúcsokat tartalmaztak ugyanazon a helyen, akkor a szekvenáló szoftver valószínűleg hibás nukleotidokat tartalmazott., Ez a hiba manuálisan azonosítható és kijavítható a szövegfájlban. A széles csúcsok jelenléte a kromatogramban a felbontás elvesztését jelzi, ami a nukleotidok elszámolását okozza a kapcsolódó régiókban. Ezt a hibát nehéz kijavítani, és a következő lépések bármelyikében az eltéréseket megbízhatatlannak kell tekinteni. A gyenge kromatogram olvasási minőség, amelyet több csúcs jelenléte jelez, általában a szekvencia öt prím-és három prímvégén fordul elő. Néhány szekvenáló program automatikusan eltávolítja ezeket az alacsony minőségű szakaszokat., Ha a sorozat nem lett automatikusan csonkolva, azonosítsa az alacsony minőségű töredékeket, majd távolítsa el a megfelelő bázisokat a szövegfájlból.
használjon DNS-összeállítási programot a két primer szekvencia egyetlen folyamatos szekvenciába történő összeállításához. Ne feledje, hogy az előre-hátra alapozókkal kapott szekvenciáknak részben átfedniük kell egymást. A DNS-összeszerelési programban helyezze be a két szekvenciát FASTA formátumban a megfelelő mezőbe. Ezután kattintson a Küldés gombra, majd várja meg, amíg a program visszaadja az eredményeket.
az összeszerelt sorozat megtekintéséhez kattintson a Contigs elemre az Eredmények lapon., Ezután az igazítás részleteinek megtekintéséhez válassza az összeszerelés részletei lehetőséget. Keresse meg a weboldalt az alapvető helyi igazítás kereső eszköz, vagy robbanás, majd válassza ki a nukleotid robbanás eszköz összehasonlítani a szekvenciát az adatbázis. Írja be a sorozatot a lekérdezési sorrend szövegmezőjébe, majd válassza ki a megfelelő adatbázist a görgetés lefelé menüben. Végül kattintson az oldal alján található robbanás gombra, majd várja meg, amíg az eszköz visszaadja a legtöbb hasonló szekvenciát az adatbázisból.
ebben a példában a felső találat B., subtilis törzs 168, mutató 100% identitás a sorozat a robbanás adatbázisban. Ha a top hit nem mutatja 100% – os identitás a várható faj vagy törzs, kattintson a sorrendben, amely leginkább megfelel a lekérdezés, hogy a részleteket az igazítás. Az igazított nukleotidokat rövid függőleges vonalak kötik össze, a nem megfelelő nukleotidoknak pedig rések lesznek közöttük. Összpontosítva az azonosított egyező régiók, felülvizsgálja a sorozatot, majd ismételje meg a robbanás keresés, ha szükséges.