3.1.2.2. HPLC
HPLC unter Verwendung von mobilen Phasen auf Acetonitril – oder Hexanbasis ermöglicht den direkten Nachweis von Phospholipiden ohne vorherige Bereinigung des Rohextrakts, wodurch diese Methoden einfach und schnell sind. Diese Methoden trennen jedoch nicht effektiv die verschiedenen Inositolphospholipide. Nakamura et al. (1989) haben ein HPLC-Verfahren entwickelt, das speziell PtdIns und PtdInsP2 im Gehirn analysiert., Bei diesem Verfahren wird der Lipidextrakt zunächst mit 9-Anthryldiazomethan derivatisiert, um (9-Anthryl) PtdInsP und di(9-Anthryl) PtdInsP2 herzustellen und dann wird die derivatisierte Probe durch HPLC mit UV-Detektion bei 245 nm getrennt. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn und SM werden mit diesem Reagenz nicht derivatisiert und stören daher den Assay nicht (Yamada et al., 1988). Diese Methode ist empfindlicher als die unterivatisierte UV-Nachweismethode zur Analyse der Inosit-Phospholipide.
Low (1990) hat die Verwendung von DEAE-Zellulosesäulen zur präparativen HPLC von Gehirnlipiden beschrieben., Die Gehirn Phospholipide gelöst in 50 ml Lösungsmittel A (Chloroform/Methanol / H2O, 20: 9: 1, vol.) und auf die Cellulosesäule (DEAE Cellulose, Sigma) aufgetragen, die zur Neutralität mit Alkali und Säure gewaschen wird. Die gewaschene DEAE-Cellulose wird in eine Glassäule (2 cm × 38 cm) mit lösungsmittelbeständigen Beschlägen verpackt. Die Säule wird dann mit einer Flussrate von 100 ml/h mit 1 1 linearem Gradienten von 100% Lösungsmittel A bis 100% Lösungsmittel B (Lösungsmittel A mit 0,6 M Ammoniumacetat) eluiert und 13-15 ml Fraktionen werden gesammelt und auf Phosphor untersucht (Abb. 3.3).,
Abb. 3.3. Isolierung von PtdInsPs aus dem Rinderhirn durch eine DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie. Säure gewaschene Methanol-gefällte Folchfraktion wurde aus einer DEAE-Cellulose-Säule mit einem Gradienten von 100% Lösungsmittel A (Chloroform / Mefhanol/H2O, 20: 9: 1, vol.) bis 100% Lösungsmittel B (Lösungsmittel A mit 0,6 M Ammoniumacetat) und 13-15 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden auf organischen Phosphor getestet. Die durchschnittliche Rückgewinnung von angewandtem organischem Phosphor betrug etwa 90%., Die peak-eluting Bruchteil-Nummer. Fünfundzwanzig war reproduzierbar vorhanden, wurde aber nicht identifiziert. Die Zusammensetzung der Peaks wurde durch TLC-Analyse gepoolter Fraktionen bestimmt. Peaks werden wie in der Abbildung gezeigt identifiziert.
Reproduziert von Low (1990) mit Genehmigung des Herausgebers.
Alternativ führte Low (1990) den chromatographischen Schritt durch präparative HPLC unter Verwendung einer Amino-Spalte durch. Die Gehirnphospholipide wurden in 5 ml Lösungsmittel A gelöst und mit einer Flussrate von 2 aufgetragen.,5 ml / min auf eine 10 mm × 250 mm Amino-NP-Säule (5 µm sphärische Kieselsäure mit n-Propylamin-gebundener Phase, IBM Instruments, Danbury, CT) mit einer 4,5 mm × 50 mm Schutzsäule, die mit Lösungsmittel A ausgeglichen ist.Die Säule wird mit einer Flussrate von 2,5 ml/min mit 25 ml Lösungsmittel A, einem 125 ml Gradienten von 100% Lösungsmittel A bis 100% Lösungsmittel B und 100 ml 100% Lösungsmittel B eluiert; 5 ml Fraktionen werden gesammelt. Die gepoolten Fraktionen werden durch Einstellen auf 18 ml mit Lösungsmittel A und den extrahierten Phospholipiden konzentriert. Die durchschnittliche Rückgewinnung von organischem Phosphor beträgt 80%., Eine vollständige Trennung von PtdIns (90 ml), PtdInsP (150 ml) und PtdInsP2 (160-200 ml) erhalten wurde (Chromatogramm nicht gezeigt). Die PtdIns überschneiden sich jedoch mit PtdSer. Die Zusammensetzung der Peaks wurde mit TLC von gepoolten Fraktionen bestimmt.
Low(1990) hat auch eine HPLC-Reinigung der markierten PtdIne(4)P und PtdIne (4,5)P2 aus menschlichen Thrombozyten beschrieben. Der Lipidextrakt aus Blutplättchen wurde aus 60 ml frischem menschlichem Blut in Gegenwart von Methanol ausgefällten Rinderhirn-PtdInsPs als Träger hergestellt, wird schließlich in 0 wieder aufgelöst.,5 1 Lösungsmittel A und mit einer Flussrate von 1 ml/min auf eine 4,5 mm × 250 mm Amino-NP-Säule aufgetragen, die in Lösungsmittel A ausgeglichen ist. Die Säule wird mit 5 ml Lösungsmittel A eluiert (ein 25 ml linearer Gradient von 100% Lösungsmittel A bis 100% Lösungsmittel B), und 20 ml Lösungsmittel B. Eine Milliliterfraktion wird gesammelt und die Radioaktivität durch Flüssigkeitsszintillationszählung bestimmt. Die durchschnittliche Rückgewinnung der angewandten Radioaktivität beträgt etwa 70%. Es gibt eine ausgezeichnete Auflösung der drei Inositolphosphatide, aber die PtdIne überlappen sich mit PtdOH., Daher ist dieses HPLC-Verfahren nicht zur Herstellung von PTDINEN geeignet, da PtdOH, das bei den meisten Zelltypen schneller durch Pi markiert wird, nicht daraus aufgelöst wird. Es ist wahrscheinlich, dass andere anionische Phospholipide wie PtdSer durch die Amino-NP-Säule schlecht aus PTDINEN gelöst werden, wie dies beim DEAE-Cellulose-Verfahren beobachtet wird.
Wie oben besprochen, ist keines der oben genannten Verfahren wirksam, um die einzelnen PtdInsPs in reiner Form von Rohgewebeextrakten zu trennen. Daher müssen die Lipidextrakte in mehreren chromatographischen Schritten verarbeitet werden., Zu diesem Zweck wird der Extrakt zunächst einer Sephadex-Chromatographie zur Abtrennung der Lipide von den Nichtlipiden im Extrakt unterzogen. Die Lipidfraktion wird dann auf eine DEAE-Säule gegossen, die mit verschiedenen Lösungsmitteln eluiert wird. Die PtdInsPs werden durch Elution mit Chloroform/Methanol/Ammoniumsalz als letzter Elutionsschritt zurückgewonnen. Die einzelnen Fraktionen werden bei 45°C unter Stickstoff auf 100 µl konzentriert und dann wird der konzentrierte Rückstand durch Kartuschen-Spalten-Chromatographie, TLC, HPLC oder andere chromatographische Verfahren weiter getrennt.,
Singh(1992) hat die Extraktion und Analyse von PtdIns, PtdIns(4)P und PtdIns (4,5)P2 unter Verwendung einer Sep-Pak-Patrone beschrieben. Ein Gesamtlipidextrakt (Folch et al., 1957) von Rattenhirnsynaptosomen und Mikrogefäßen hergestellt und die erste erzeugte Fraktion (Fraktion 1) wurde gesammelt und weiter extrahiert, um Phospholipide und Glycolipide zu trennen, wie von Dugan et al. (1986). Die Phospholipidfraktion wurde einer DEAE-Cellulose-Chromatographie (Trennsequenz 4) unterzogen, wie sie von Rouser et al. (1969) zur weiteren Reinigung der Inositollipide., Der gereinigte Extrakt wurde in eine Sep-Pak-Patrone überführt. Verschiedene Inositollipide werden aus der Säule mit einem linearen Gradienten von Ammoniumacetat und Wasser von 0,5% Ammoniumacetat (200 mM) und 99,5% Wasser auf 75% Ammoniumacetat und 25% Wasser in 60 min bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min eluiert (siehe Kapitel 2). Das Säuleneluat für 120 min wurde in 1-ml-Fraktionen gesammelt. Verschiedene Peaks wurden identifiziert, indem PtdIns, PtdIns(4)P und PtdIns(4,5)P2 Peaks als Referenzpunkte verwendet wurden., Die Fraktionen, die einzelne Inositollipide enthielten, wurden von HPLC gebündelt und analysiert, wie von Geurts van Kessel et al. (1977). Einzelne Phospholipide wurden bei 206 nm mit einem Dioden-Array-Detektor nachgewiesen, der programmiert ist, um einen 200-350 nm-Bereich zu scannen. Singh (1992) hat eine 50-90% ige Erholung von PTDINEN und InsPs aus Gehirnproben gezeigt. InsP3 und InsP4 zeigten die geringste Erholung aufgrund schlechter Quantifizierung und nicht aufgrund einer schlechten Extraktionsmethode. Die Patrone Methoden nicht angewandt worden, die zur Isolierung der PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2 und PtdIns (3,4,5)P3.
Cronholm et al., (1992) haben die Isolierung von PtdInsPs von Ratten Pankreas beschrieben. Jede Bauchspeicheldrüse wurde sofort in 3 ml Chloroform/Methanol (1:2, v/v) homogenisiert, und etwa 3 MBq 3H-markierte PtdIne(4)P oder PtdIne(4,5)P2 wurden zusammen mit 0,6 ml 1,2 aq zugegeben. HCl vor der Extraktion mit Chloroform, wie von Schacht (1981) beschrieben. Methanol wurde den gepoolten und gewaschenen Extrakten zugesetzt, um Chloroform/Methanol zu erhalten (3:2, v/v). Die Lösung wurde auf die Lipidex-DEAE-Säule aufgetragen, und die meisten Lipide wurden mit Chloroform/Methanol (3:2, v/v) oder Chloroform/Methanol/Wasser (3:6:1 nach vol.)., PtdIns und PtdSer wurden zusammen mit 0,03 M H3PO4 und nicht identifiziertem Material mit 0,1 M H3PO4 eluiert. PtdIne(4)P wurde mit 0,25 M H3PO4 und PtdIne (4,5)P2 mit 0,5 M H3PO4 eluiert, wie durch die eluierte Radioaktivität angezeigt. Alle Fraktionen wurden mit 0,4 ml Wasser/ml Eluat extrahiert. Die obere Phase wurde mit 0,1 vol wieder extrahiert. von chloroform. Die gepoolten Chloroformphasen wurden mit 0,4 vol gewaschen. 0,5 M HCl in 50% aq. methanol. Die Fraktionen wurden zur Bestimmung molekularer Spezies durch FAB/MS verwendet (siehe unten).
Gunnarsson et al., (1997) verwendete Normalphase HPLC mit Verdunstungslichtstreuungsdetektion für die Analyse von kommerziellen Proben von PtdInsPs zusammen mit anderen Phospholipiden. Unter Verwendung eines linearen Gradienten von A, Chloroform / Methanol / Ammoniak (50:45:3, durch vol.) und B, chloroform/methanol/Wasser/Ammoniak (25:55:17:3, vol.) gut aufgelöste spät auftretende Peaks für PtdIne(4)P und PtdIne (4,5)P2 werden erhalten. Die Dosisreaktionskurven für PtdIne(4)P und PtdIne (4,5)P2 waren nicht linear, was für den Lichtstreuungsdetektor charakteristisch ist (Ergebnisse nicht gezeigt)., Für die meisten Zwecke ist die HPLC-Technik in Auflösung, Geschwindigkeit und Komfort dem DEAE-Cellulose-Verfahren überlegen und ist die Methode der Wahl, wenn HPLC-Geräte verfügbar sind. DEAE-Cellulose ist billig und großflächige Reinigung könnte die Verwendung dieses Materials erfordern. Das HPLC-Verfahren ist auch einigen oder in jeder Hinsicht alternativen Verfahren zur Reinigung von Polyphosphoinositiden überlegen, z. B. der präparativen TLC – oder Neomycinaffinitätschromatographie.