La Terre abrite des millions d’espèces bactériennes, chacune avec des caractéristiques uniques. L’identification de ces espèces est essentielle à l’évaluation des échantillons environnementaux. Les médecins doivent également distinguer différentes espèces bactériennes pour diagnostiquer les patients infectés.
Pour identifier les bactéries, une variété de techniques peuvent être utilisées, y compris l’observation microscopique de la morphologie ou de la croissance sur un milieu spécifique pour observer la morphologie des colonies., L’analyse génétique, une autre technique d’identification des bactéries, a gagné en popularité ces dernières années, en partie grâce au séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S.
Le ribosome bactérien est un complexe d’ARN protéique composé de deux sous-unités. La sous-unité 30S, la plus petite de ces deux sous-unités, contient l’ARNr 16S, qui est codé par le gène de l’ARNr 16S contenu dans l’ADN génomique. Des régions spécifiques de l’ARNr 16S sont hautement conservées, en raison de leur fonction essentielle dans l’assemblage des ribosomes. Alors que d’autres régions, moins critiques pour fonctionner, peuvent varier selon les espèces bactériennes., Les régions variables de l’ARNr 16S peuvent servir d’empreintes moléculaires uniques pour les espèces bactériennes, ce qui nous permet de distinguer des souches phénotypiquement identiques.
Après avoir obtenu un échantillon de qualité de l’ARND, la PCR du gène codant l’ARNr 16S peut commencer. La PCR est une méthode de biologie moléculaire couramment utilisée, consistant en des cycles de dénaturation du modèle d’ADN double brin, le recuit de paires d’amorces universelles, qui amplifient les régions hautement conservées du gène, et l’extension des amorces par l’ADN polymérase., Alors que certaines amorces amplifient la plupart du gène codant l’ARNr 16S, d’autres n’en amplifient que des fragments. Après PCR, les produits peuvent être analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Si l’amplification a réussi, le gel devrait contenir une seule bande d’une taille attendue, selon la paire d’amorces utilisée, jusqu’à 1500bp, la longueur approximative du gène de l’ARNr 16S.
Après purification et séquençage, les séquences obtenues peuvent ensuite être entrées dans la base de données BLAST, où elles peuvent être comparées aux séquences d’ARNr de référence 16S., Comme cette base de données renvoie des correspondances basées sur la similitude la plus élevée, cela permet de confirmer l’identité des bactéries d’intérêt. Dans cette vidéo, vous observerez le séquençage du gène de l’ARNr 16S, y compris la PCR, l’analyse et l’édition de séquences d’ADN, l’assemblage de séquences et la recherche de bases de données.
Lors de la manipulation de micro-organismes, il est essentiel de suivre de bonnes pratiques microbiologiques, notamment en utilisant une technique aseptique et en portant un équipement de protection individuelle approprié. Après avoir effectué une évaluation appropriée des risques pour le micro-organisme ou l’échantillon environnemental d’intérêt, obtenir une culture d’essai., Dans cet exemple, une culture pure de Bacillus subtilis est utilisée.
Pour commencer, cultivez votre micro-organisme sur un milieu approprié dans les conditions appropriées. Dans cet exemple, Bacillus subtilis 168 est cultivé dans un bouillon LB pendant la nuit dans un incubateur agité réglé à 200 tr / min à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un kit disponible dans le commerce pour isoler l’ADN génomique ou l’aDNG de 1,5 millilitres de la culture de nuit de B. subtilis.
Pour vérifier la qualité de l’ADN isolé, mélangez d’abord cinq microlitres du gDNA isolé avec un microlitre de colorant chargé de gel d’ADN. Ensuite, chargez l’échantillon sur un 0.,gel d’agarose à 8%, contenant un réactif de coloration de l’ADN, tel que SYBR safe ou EtBr. Après cela, chargez un étalon de masse moléculaire d’une kilobase sur le gel et exécutez l’électrophorèse jusqu’à ce que le colorant avant soit à environ 0,5 centimètre du fond du gel. Une fois l’électrophorèse sur gel terminée, visualisez le gel sur un transilluminateur à lumière bleue. Le gDNA devrait apparaître comme une bande épaisse, de taille supérieure à 10 kilobase et avoir un maculage minimal.
Après cela, pour créer des dilutions en série du gDNA, étiquetez trois tubes de microcentrifugeuse comme 10X, 100X et 1000X., Ensuite, utilisez une pipette pour distribuer 90 microlitres d’eau distillée stérile dans chacun des tubes. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution gDNA au tube 10X. Pipeter tout le volume de haut en bas pour s’assurer que la solution est bien mélangée. Ensuite, retirez 10 microlitres de la solution du tube 10X et transférez-le dans le tube 100X. Mélanger la solution comme décrit précédemment. Enfin, transférer 10 microlitres de la solution dans le tube 100X, vers le tube 1000X.
Pour commencer le protocole PCR, décongeler les réactifs nécessaires sur de la glace. Ensuite, préparez le mélange maître PCR., Étant donné que l’ADN polymérase est active à température ambiante, la réaction mise en place doit se produire sur de la glace. Aliquoter 49 microlitres du mélange maître dans chacun des tubes PCR. Ensuite, ajoutez un microlitre de gabarit à chacun des tubes expérimentaux et un microlitre d’eau stérile au tube de contrôle négatif, en pipetant de haut en bas pour mélanger. Après cela, réglez la machine PCR selon le programme décrit dans le tableau. Placez les tubes dans le thermocycleur et démarrez le programme.,
Une fois le programme terminé, examinez la qualité de votre produit par électrophorèse sur gel d’agarose, comme démontré précédemment. Une réaction réussie utilisant le protocole décrit devrait donner une seule bande d’environ 1,5 kilobase. Dans cet exemple, l’échantillon contenant 100 fois le gDNA dilué a donné le produit de la plus haute qualité. Ensuite, purifiez le meilleur produit PCR, dans ce cas, le 100X gDNA, avec un kit disponible dans le commerce. Maintenant, le produit PCR peut être envoyé pour le séquençage.
Dans cet exemple, le produit PCR est séquencé à l’aide d’amorces avant et arrière., Ainsi, deux ensembles de données, contenant chacun une séquence d’ADN et un chromatogramme d’ADN, sont générés: l’un pour l’amorce avant et l’autre pour l’amorce inverse. Tout d’abord, examinez les chromatogrammes générés à partir de chaque amorce. Un chromatogramme idéal devrait avoir des pics uniformément espacés avec peu ou pas de signaux de fond.
Si les chromatogrammes affichent des pics doubles, plusieurs modèles d’ADN peuvent avoir été présents dans les produits de PCR et la séquence doit être éliminée. Si les chromatogrammes contenaient des pics de couleurs différentes au même endroit, le logiciel de séquençage a probablement mal appelé nucléotides., Cette erreur peut être identifiée et corrigée manuellement dans le fichier texte. La présence de larges pics dans le chromatogramme indique une perte de résolution, ce qui provoque une mauvaise comptabilisation des nucléotides dans les régions associées. Cette erreur est difficile à corriger et les incohérences dans l’une des étapes suivantes doivent être traitées comme non fiables. La mauvaise qualité de lecture du chromatogramme, indiquée par la présence de plusieurs pics, se produit généralement aux cinq extrémités premières et aux trois extrémités premières de la séquence. Certains programmes de séquençage suppriment automatiquement ces sections de faible qualité., Si votre séquence n’a pas été tronquée automatiquement, identifiez les fragments de faible qualité et supprimez leurs bases respectives du fichier texte.
Utilisez un programme d’assemblage d’ADN pour assembler les deux séquences d’amorces en une séquence continue. N’oubliez pas que les séquences obtenues à l’aide d’amorces avant et arrière doivent se chevaucher partiellement. Dans le programme d’assemblage d’ADN, insérez les deux séquences au format FASTA dans la case appropriée. Ensuite, cliquez sur le bouton Soumettre et attendez que le programme renvoie les résultats.
Pour afficher la séquence assemblée, cliquez sur Contigs dans l’onglet Résultats., Ensuite, pour afficher les détails de l’alignement, sélectionnez détails d’assemblage. Accédez au site Web de l’outil de recherche d’alignement local de base, ou BLAST, et sélectionnez l’outil nucleotide BLAST pour comparer votre séquence à la base de données. Entrez votre séquence dans la zone de texte Séquence de requête et sélectionnez la base de données appropriée dans le menu déroulant. Enfin, cliquez sur le bouton BLAST en bas de la page et attendez que l’outil renvoie les séquences les plus similaires de la base de données.
Dans cet exemple, le hit supérieur est B., subtilis souche 168, montrant 100% d’identité avec la séquence dans la base de données BLAST. Si l’accès supérieur ne montre pas 100% d’identité à votre espèce ou souche attendue, cliquez sur la séquence qui correspond le mieux à votre requête pour voir les détails de l’alignement. Les nucléotides alignés seront joints par de courtes lignes verticales et les nucléotides incompatibles auront des espaces entre eux. En vous concentrant sur les régions non appariées identifiées, révisez la séquence et répétez la recherche d’explosion si vous le souhaitez.