Observation
Une grande partie des progrès en microbiologie a dépendu de l’étude des « cultures pures.” Ce sont des cultures qui ne contiennent qu’un seul type de cellule, idéalement avec la culture dérivée d’une cellule unique initiale., Depuis le développement précoce de méthodes pour établir des cultures pures (1), il y a eu de nombreux exemples dans lesquels des cultures qui étaient initialement considérées comme pures ont ensuite été trouvées pour contenir deux types de microbes. Dans certains cas, ces cultures multi-espèces par inadvertance ont mené à des percées importantes, comme la découverte du transfert d’hydrogène interspécifique (2). Cependant, avec l’avènement des technologies de séquençage profond, on pourrait raisonnablement prévoir que les contaminants non détectés dans les cultures ne seraient plus une préoccupation importante.,
La souche PCA de Geobacter sulfurreducens a été isolée au milieu des années 1990 en utilisant des techniques standard d’enrichissement et d’isolement qui comprenaient la dilution jusqu’à l’extinction en milieu liquide, suivie de stries répétées de colonies isolées sur milieu solidifié en gélose (3). C’est la stratégie classique enseignée dans les manuels d’introduction à la microbiologie les plus populaires (4-6). Plus tard, la souche DL1 de G. sulfurreducens a été obtenue en restreignant davantage les colonies isolées de PCA (7). Avec le développement de méthodes pour la manipulation génétique de G. sulfurreducens (7) et le séquençage de son génome (8), G., sulfurreducens est devenu l’espèce Geobacter de choix pour l’étude de la physiologie et de nouvelles propriétés de transfert d’électrons extracellulaires de ce genre important pour l’environnement (9). Le séquençage initial du gène ARNr 16S dans la culture (3), ainsi que le séquençage du génome d’abord à 8 fois (8) puis à 80 fois (10, 11), ont indiqué que la culture ne contenait qu’une seule souche.,
Dans une tentative d’évolution adaptative de DL1 pour produire plus de courant, il a été inoculé dans un système bioélectrique avec une anode en graphite à un potentiel (-400 mV par rapport à Ag/AgCl) considéré comme proche de la limite inférieure à laquelle la génération de courant à partir d’acétate serait possible (12). Un isolat obtenu à partir du biofilm d’anode, désigné G., la souche KN400 (12) de sulfurreducens est supérieure à la souche inoculum dans la production de courant électrique, et cette supériorité est attribuée au moins en partie à sa capacité à produire plus de « nanofils microbiens”, des filaments de protéines électriquement conducteurs qui présentent une conductivité électrique de type métallique (13, 14).
On a d’abord supposé que la souche KN400 avait accumulé une ou plusieurs mutations qui augmentaient sa capacité de transfert extracellulaire d’électrons., Cela serait analogue à la sélection de souches mutantes au cours de l’évolution adaptative de la souche DL1 pour l’échange d’électrons avec d’autres organismes (11) ou des taux plus élevés de réduction de l’oxyde de Fe(III) (10). Cependant, la génomique comparative a révélé que la séquence génomique de la souche KN400 contenait plus de 27 270 polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) (15). Un tiers des gènes présentaient au moins un polymorphisme nucléotidique et un quart un polymorphisme qui affectait la séquence protéique résultante (15). Basé sur des taux de mutation typiques de 6.,3 × 10-9 / pb par génération (16), il faudrait plus de 1 000 ans pour accumuler autant de mutations dans la souche DL1. De plus, il n’y a pas d’orthologues dans la souche DL1 pour 139 des cadres de lecture ouverts (ORF) du génome de la souche KN400, dont la plupart sont les plus étroitement liés à des gènes dans des organismes phylogénétiquement divers (15).
Ces considérations et le fait que les ORF propres au KN400 n’ont pas été détectés lors du reséquencement de la culture d’inoculum (10, 11) ont conduit à l’hypothèse que KN400 est entré dans le système bioélectrochimique en tant que contaminant., Pour évaluer cette possibilité, la pureté de la culture DL1 a été évaluée avec une sensibilité encore plus élevée.
DL1 et KN400 contiennent tous deux des OMC, un gène pour un cytochrome de surface externe qui a l’une des proportions les plus élevées de SNPs (36 SNPs / kb) entre les deux souches (15). Ce gène a été amplifié à partir de la culture DL1 qui avait été utilisée pour inoculer le système bioélectrochimique, et les produits PCR ont été séquencés avec Illumina Hi-Seq 2000 (voir le texte S1 dans le matériel supplémentaire)., La séquence KN400 a été détectée, indiquant que KN400 était présent dans l’inoculum initial utilisé pour l’étude de sélection des anodes. Cependant, sur les >107 séquences de haute qualité récupérées, seulement 286 étaient des séquences KN400 contre 1,5 × 107 séquences DL1 (tableau 1).
Text S1
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Estimations de l’abondance de la souche KN400 dans diverses culturesa
Tableau S1
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L’abondance relative de la souche KN400 dans cette même culture a été évaluée par PCR quantitative (qPCR) avec un jeu d’amorces spécifique à un gène trouvé uniquement dans KN400 (voir le texte S1 et le Tableau S1 dans le matériel supplémentaire) et un jeu d’amorces qui a détecté à la fois KN400 et DL1 (voir le Tableau S1 dans le matériel supplémentaire)., L’abondance relative de la séquence spécifique au KN400 était semblable à celle des séquences du KN400 OMC déterminées par l’approche de séquençage (tableau 1). L’analyse de séquence et l’analyse qPCR de la culture de PCA déposée à ATCC ont révélé la présence de KN400 à une abondance similaire faible (tableau 1).
Nous avons tenté d’éliminer le contaminant rare KN400 de la culture DL1 en restreaking répété de colonies isolées cultivées sur milieu acétate-fumarate solidifié (7), mais la souche KN400 a continué de persister à basse fréquence dans les colonies isolées (tableau 1)., Cependant, une culture dans laquelle KN400 ne pouvait plus être détectée a été obtenue dans un milieu acétate-fumarate liquide (voir le texte S1 dans le matériel supplémentaire) dans lequel la dilution la plus élevée présentant une croissance a été soumise à plusieurs séries successives de dilution en série (tableau 1). Ceci a démontré que la souche DL1 ne nécessite pas la présence rare de KN400 pour se développer dans le milieu acétate-fumarate sur lequel cette culture est régulièrement maintenue.
Lorsque KN400 pur et la culture DL1 sans KN400 ont été inoculées dans un milieu acétate-fumarate en quantités égales, DL1 a surpassé KN400 (Fig., 1a). Ceci est cohérent avec la constatation que lorsque les deux souches ont été cultivées séparément, DL1 a augmenté beaucoup plus rapidement que KN400 (densité optique à 600 nm de 0,04 pour KN400 contre 0,65 pour DL1 après 36 h d’incubation; voir Fig. S2 dans le matériau supplémentaire) dans le même support. La proportion de KN400 a continué de diminuer avec des transferts consécutifs (1% d’inoculum) jusqu’à ce que l’abondance de KN400 soit comparable à celle des cultures de stock PCA et DL1 (voir le texte S1 dans le matériel supplémentaire). KN400 a persisté à ce niveau bas avec d’autres transferts (Fig. 1a).,
Figure S2
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Croissance et activité de la souche KN400 dans différentes conditions de croissance. (a) Abondance relative de KN400 dans les transferts successifs au milieu du log (1% d’inoculum) d’une culture initiée avec des proportions égales de KN400 et de DL1. Les résultats sont les moyennes et les écarts types des cultures en trois exemplaires. b) Production actuelle lorsque la culture DL1 a été introduite dans la chambre d’anode d’un système bioélectrochimique avec une anode en graphite à -400 mV par rapport à Ag/AgCl. La culture sans KN400 n’a produit aucun courant pendant cette période., (c) Abondance relative de KN400 dans les biofilms anodiques lorsque l’inoculum initial était la culture DL1 qui a ensuite été trouvée pour contenir également KN400. Les résultats sont les moyennes et les écarts types des cultures en trois exemplaires.
Les tentatives répétées pour cultiver la culture DL1 sans KN400 sur une anode située à -400 mV ont échoué. Cependant, le courant a été facilement produit dans une autre série d’expériences dans lesquelles la culture DL1 contenant KN400 a servi d’inoculum (Fig. 1b)., Une analyse qPCR de l’ADN extrait du biofilm d’anode a indiqué que 100% des séquences d’OMC étaient KN400 dans le deuxième transfert (Fig. 1c). Ces résultats suggèrent que la raison pour laquelle KN400 a émergé sur les anodes était que la souche DL1 n’était pas capable de croître dans les conditions imposées. Sans cette pression sélective inhabituelle, KN400 serait resté non détecté dans les cultures PCA et DL1 même par les méthodes de séquençage de nouvelle génération actuellement disponibles qui peuvent théoriquement fournir une couverture mille fois dans le séquençage du génome.,
Les facteurs contribuant à la persistance à long terme de la souche KN400 à une fréquence extrêmement basse dans la culture DL1 restent un mystère. L’importance d’isoler physiquement des cellules individuelles par des méthodes plus définitives que la strie sur milieu solide pour établir des cultures pures est reconnue depuis un certain temps (17), et des méthodes de plus en plus sophistiquées pour y parvenir continuent d’être développées (18-23)., Cependant, les méthodes de placage utilisées depuis plus de 100 ans et enseignées à tous les étudiants en microbiologie comme procédures standard pour obtenir des cultures pures (4-6) restent les plus courantes. Les résultats présentés ici démontrent que sans isolement unicellulaire, les contaminants cryptiques peuvent survivre à très basse fréquence dans les cultures au cours de décennies d’investigation intensive et peuvent échapper à la détection par les méthodes de séquençage les plus sophistiquées actuellement disponibles.,
Figure S1
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