3.1.2.2. HPLC
La HPLC utilisant des phases mobiles à base d’acétonitrile ou d’hexane permet la détection directe des phospholipides sans nettoyage préalable de l’extrait brut, rendant ainsi ces méthodes simples et rapides. Cependant, ces méthodes ne séparent pas efficacement les différents phospholipides d’inositol. Nakamura et coll. (1989) ont développé une procédure de CLHP qui analyse spécifiquement PtdIns et PtdInsP2 dans le cerveau., Dans cette méthode, l’extrait lipidique est d’abord dérivé avec du 9-anthryldiazométhane pour produire du (9-anthryl) PtdInsP et du di(9-anthryl) PtdInsP2, puis l’échantillon dérivé est séparé par CLHP avec détection UV à 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn et SM ne sont pas dérivatisés avec ce réactif et, par conséquent, n’interfèrent pas avec le dosage (Yamada et al., 1988). Cette méthode est plus sensible que la méthode de détection UV sous-utilisée pour l’analyse des phospholipides d’inositol.
Low (1990) a décrit l’utilisation de colonnes de cellulose DEAE pour la CLHP préparative des lipides cérébraux., Les phospholipides cérébraux dissous dans 50 ml de Solvant A (chloroforme / méthanol / H2O, 20:9: 1, par vol.) et appliqué sur la colonne de cellulose (DEAE cellulose, Sigma), qui est lavée avec de l’alcali et de l’acide à la neutralité. La cellulose DEAE lavée est emballée dans une colonne de verre (2 cm × 38 cm) avec des raccords résistants aux solvants. La colonne est ensuite éluée à un débit de 100 ml / h avec 1 1 gradient linéaire de 100% de Solvant A à 100% de Solvant B (Solvant A contenant 0,6 M d’acétate d’ammonium) et des fractions de 13-15 ml sont collectées et analysées pour le phosphore (Fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Isolement de PtdInsPs du cerveau bovin par une chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose. La fraction de Folch précipitée par méthanol lavé à l’acide a été éluée à partir d’une colonne de DEAE-cellulose avec un gradient de 100% de Solvant A (chloroforme/mefhanol/H2O, 20:9:1, par vol.) à 100% de solvant B (Solvant A contenant 0,6 M d’acétate d’ammonium) et 13-15 ml de fractions collectées. Les fractions ont été analysées pour le phosphore organique. La récupération moyenne du phosphore organique appliqué était d’environ 90%., Le pic éluant au nombre de fraction. Vingt-cinq est reproductible présent mais n’a pas été identifié. La composition des pics a été déterminée par l’analyse TLC des fractions mises en commun. Les pics sont identifiés comme indiqué sur la figure.
Reproduit à partir de Low (1990) avec la permission de l’éditeur.
Alternativement, Low (1990) a effectué l’étape chromatographique par CLHP préparative en utilisant une colonne amino. Les phospholipides cérébraux ont été dissous dans 5 ml de solvant A et ont été appliqués à un débit de 2.,5 ml/min à une colonne amino-NP de 10 mm × 250 mm (silice sphérique de 5 µm avec phase liée à la n-propylamine, IBM Instruments, Danbury, CT) avec une colonne de protection de 4,5 mm × 50 mm équilibrée avec le Solvant A. La colonne est éluée à un débit de 2,5 ml/min avec 25 ml de Solvant A, un gradient de 125 ml de 100% de Solvant A à 100% de Solvant B et 100 ml de 100% de Solvant B; 5 ml de fractions sont collectées. Les fractions mises en commun sont concentrées par ajustement à 18 ml avec le solvant A et les phospholipides extraits. La récupération moyenne du phosphore organique est de 80%., Une séparation complète de PtdIns (90 ml), PtdInsP (150 ml) et PtdInsP2 (160-200 ml) a été obtenue (chromatogramme non représenté). Le PtdIns, cependant, chevauche PtdSer. La composition des pics a été déterminée avec TLC de fractions regroupées.
Low (1990) a également décrit une purification par CLHP des PtdIns(4)P et des PtdIns(4,5)P2 marqués à partir de plaquettes humaines. L’extrait lipidique des plaquettes a été préparé à partir de 60 ml de sang humain frais en présence de PtdInsPs de cerveau bovin précipité au méthanol en tant que transporteur, est finalement redissolved en 0.,5 1 de Solvant A et appliqué à un débit de 1 ml / min à une colonne amino-NP de 4,5 mm × 250 mm équilibrée dans le Solvant A. La colonne est éluée avec 5 ml de Solvant A (un gradient linéaire de 25 ml de 100% de Solvant A à 100% de Solvant B), et 20 ml de Solvant B. Des fractions d’un millilitre sont collectées et la radioactivité déterminée par comptage par scintillation liquide. La récupération moyenne de la radioactivité appliquée est d’environ 70%. Il existe une excellente résolution des trois phosphatides d’inositol, mais les PtdIns chevauchent PtdOH., Par conséquent, cette procédure de CLHP ne convient pas à la préparation de PtdIns puisque PtdOH, qui dans la plupart des types de cellules est marqué plus rapidement par Pi, n’est pas résolu à partir de celui-ci. Il est probable que d’autres phospholipides anioniques tels que PtdSer seront mal résolus à partir des PTDINES par la colonne amino-NP, comme observé avec la procédure DEAE-cellulose.
Comme discuté ci-dessus, aucune des méthodes ci-dessus n’est efficace pour séparer les PtdInsPs individuels sous forme pure des extraits de tissus bruts. Par conséquent, les extraits lipidiques doivent être traités par plusieurs étapes chromatographiques., A cet effet, l’extrait est d’abord soumis à une chromatographie Sephadex pour la séparation des lipides des non-lipides dans l’extrait. La fraction lipidique est ensuite versée sur une colonne DEAE qui est éluée avec différents solvants. Les PTDINSP sont récupérés par élution avec du chloroforme/méthanol/sel d’ammonium comme étape finale d’élution. Les fractions individuelles sont concentrées à 100 µl à 45°C sous azote, puis le résidu concentré est encore séparé par chromatographie cartouche-colonne, CCM, CLHP ou d’autres procédures chromatographiques.,
Singh (1992) a décrit l’extraction et l’analyse des PtdIns, PtdIns(4)P et PtdIns(4,5)P2 à l’aide d’une cartouche Sep-Pak. Un extrait lipidique total (Folch et al., 1957) de synaptosomes cérébraux de rat et de microvaisseaux ont d’abord été préparés et la première fraction générée (Fraction 1) a été collectée et extraite pour séparer les phospholipides et les glycolipides comme décrit par Dugan et al. (1986). La fraction phospholipidique a été soumise à une chromatographie DEAE-cellulose (séquence de séparation 4) telle que décrite par Rouser et al. (1969) pour purifier davantage les lipides d’inositol., L’extrait purifié a été transféré dans une cartouche Sep-Pak. Divers lipides d’inositol sont élués de la colonne avec un gradient linéaire d’acétate d’ammonium et d’eau de 0,5% d’acétate d’ammonium (200 mM) et 99,5% d’eau à 75% d’acétate d’ammonium et 25% d’eau en 60 min à un débit de 0,5 ml/min (voir Chapitre 2). L’éluat de colonne pendant 120 min a été recueilli en fractions de 1 ml. Différents pics ont été identifiés en utilisant les pics PtdIns, PtdIns(4)P et PtdIns(4,5)P2 comme points de référence., Les fractions contenant des lipides individuels d’inositol ont été regroupées et analysées par CLHP comme décrit par Geurts van Kessel et al. (1977). Des phospholipides individuels ont été détectés à 206 nm à l’aide d’un détecteur à réseau de diodes programmé pour balayer une plage de 200 à 350 nm. Singh (1992) a démontré une récupération de 50 à 90% des PtdIns et des INSP à partir d’échantillons cérébraux. InsP3 et InsP4 ont présenté la récupération la plus faible en raison d’une mauvaise quantification plutôt que d’une mauvaise méthode d’extraction. Les méthodes à cartouche n’ont pas été appliquées pour l’isolement des PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2 et PtdIns (3,4,5)P3.
Cronholm et coll., (1992) ont décrit l’isolement des PtdInsPs du pancréas de rat. Chaque pancréas a été immédiatement homogénéisé dans 3 ml de chloroforme / méthanol(1: 2, v/v), et environ 3 MBq de PtdIns(4)P ou de PtdIns (4,5)P2 marqués au 3H ont été ajoutés avec 0,6 ml de 1,2 aq. HCl avant extraction au chloroforme, tel que décrit par Schacht (1981). Du méthanol a été ajouté aux extraits mis en commun et lavés pour donner du chloroforme/méthanol (3:2, v/v). La solution a été appliquée sur la colonne Lipidex-DEAE, et la plupart des lipides ont été élués avec du chloroforme / méthanol (3: 2, v/ v)ou du chloroforme / méthanol / eau (3: 6: 1 par vol.)., PtdIns et PtdSer ont été élués avec 0,03 M H3PO4 et du matériel non identifié avec 0,1 M H3PO4. PtdIns(4)P a été élué avec 0,25 M H3PO4 et PtdIns (4,5) P2 avec 0,5 M H3PO4 comme indiqué par la radioactivité éluée. Toutes les fractions ont été extraites avec 0,4 ml d’eau / ml d’éluat. La phase supérieure a été ré-extraite avec 0,1 vol. de chloroforme. Les phases de chloroforme regroupées ont été lavées avec 0,4 vol. de HCl de 0.5 M dans 50% aq. méthanol. Les fractions ont été utilisées pour la détermination des espèces moléculaires par FAB/MS (voir ci-dessous).
Gunnarsson et coll., (1997) ont utilisé la CLHP en phase normale avec détection de diffusion de la lumière par évaporation pour l’analyse d’échantillons commerciaux de PtdInsPs avec d’autres phospholipides. En utilisant un gradient linéaire de A, chloroforme / méthanol / ammoniac (50:45: 3, par vol.) et B, chloroforme / méthanol / eau / ammoniac (25:55:17: 3, par vol.)on obtient des pics bien résolus de PtdIns(4)P et de PtdIns(4,5) P2. Les courbes dose-réponse des PtdIns(4)P et PtdIns (4,5) P2 n’étaient pas linéaires, ce qui est une caractéristique du détecteur de diffusion de la lumière (résultats non présentés)., Pour la plupart des buts la technique de CLHP est supérieure dans la résolution, la vitesse et la commodité globale à la procédure DEAE-cellulose et est la méthode de choix si l’équipement de CLHP est disponible. DEAE-cellulose est bon marché et la purification à grande échelle pourrait nécessiter l’utilisation de ce matériau. La procédure de CLHP est également supérieure à certains ou à tous égards aux procédures alternatives pour la purification des polyphosphoinositides, par exemple TLC préparatif ou chromatographie d’affinité de néomycine.