Introduction
L’ambre gris, un produit naturel connu du cachalot , se trouve également sous forme de jetsam sur les plages du monde entier , et a été très prisé pour son utilité dans l’industrie du parfum . Bien qu « il ait longtemps été considéré que l » ambre gris de jetsam recueilli sur les plages provient de cachalots , peu ou pas de preuve de cela a jamais été publié, et des distinctions existent entre de tels échantillons et des échantillons d » ambre gris prélevés directement sur des cachalots., Par exemple, les échantillons d’ambre gris de jetsam contiennent généralement des proportions beaucoup plus élevées d’ambréine d’alcool triterpénoïde et des proportions beaucoup plus faibles de stérols que les échantillons d’ambre gris de cachalots . Inversement cependant, jetsam ambergris contient parfois des fragments de becs de calmars , et puisque les céphalopodes, tels que les calmars, constituent la principale composante alimentaire des cachalots, cela a été cité comme preuve d » une origine des coprolithes jetsam des cachalots. Il est même théorisé que l’ambre gris peut provenir d’une sécrétion pathologique de l’irritant de la chitine du bec de calmar dur ., Cependant, d’autres espèces de mammifères marins (p. ex. les membres de Globicephala et de Ziphiidae) sont également antérieures au calmar , et certaines (y compris les cachalots nains et pygmées) sont également citées comme sources potentielles d’ambre gris . Par conséquent, pour mieux élucider l’origine de l’ambre gris jetsam, nous avons analysé l’ADN d’un échantillon d’ambre gris prélevé sur un cachalot échoué aux Pays-Bas et l’avons comparé à des séquences d’ADN isolées d’ambre gris jetsam prélevées sur des plages de Nouvelle-Zélande et du Sri Lanka.,
L’ambre gris est principalement composé d’ambréine en raison de sa production à partir de squalène, un produit métabolique commun à de nombreux organismes . Ce processus peut être induit par l’influence microbienne intestinale et précipite dans des masses denses et solides à l’intérieur du côlon de baleine . Les accrétions coprolitiques qui en résultent sont compositionnellement bien adaptées à la préservation de l’ADN du côlon puisque l’ambréine est hydrophobe et apparemment résistante à la dégradation dans l’environnement entérique acide., Les preuves de radiocarbone sortir ensemble indique certainement une résistance à la dégradation microbienne et photo dans l « environnement marin jusqu » à un millénaire dans certains échantillons d » ambre gris jetsam . Nous avons émis l’hypothèse que ce matériel pourrait fournir une cache opportune pour préserver l’ADN, même après une exposition prolongée à des conditions préjudiciables en mer.
Matériel et méthodes
Des échantillons d’ambergris Jetsam de la mer du Nord, de l’Océan Indien et du Pacifique ont été analysés, représentant la distribution mondiale du matériau ., Trois échantillons d’ambre gris jetsam (un du Sri Lanka, deux de l’île Pitt, en Nouvelle-Zélande) ont été sous-échantillonnés pour l’extraction de l’ADN. Un quatrième spécimen provient de la dissection d’un cachalot mâle échoué en décembre 2012, à Razende Bol près de Texel, aux Pays-Bas. Ce dernier ambre gris « frais », provenant d’une carcasse de cachalot confirmée, a fourni une comparaison connue avec les spécimens de jetsam ayant des antécédents biologiques non confirmés. Des échantillons d’ambre gris ont été obtenus et analysés pour la teneur en ambréine et en stérols fécaux dans des études antérieures .,
L’extraction et le séquençage de l’ADN ont été effectués au GLOBE Institute, à l’Université de Copenhague, dans un laboratoire dédié à l’ADN ancien, suivant des procédures strictes pour minimiser la contamination. Environ 120 mg ont été sous-échantillonnés (figure 1 et tableau 1) pour l’extraction de l’ADN. Les échantillons ont été incubés dans un tampon contenant une protéinase K de 400 µl après Gilbert et al. à 56°C pendant 10 h; les surnageants ont ensuite été traités à l’aide d’une étape phénol–chloroforme suivant Carøe et al., et purifié à l’aide de colonnes de nettoyage d’ADN Monarch (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) selon les directives du fabricant. Les bibliothèques à double brin ont été construites à partir d’extraits d’ADN suivant le MEILLEUR protocole , conçu et prouvé spécifiquement pour le séquençage de l’ADN ancien et dégradé. Les bibliothèques ont été amplifiées et indexées par PCR en utilisant PfuTurbo Cx Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) selon les directives du fabricant., Les produits ont été mis en commun à une concentration équimolaire avant le séquençage sur une plate-forme Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA), en utilisant une chimie de lecture à une extrémité de 80 bp au Centre national danois de séquençage de l’ADN à haut débit, Copenhague, Danemark.
la Figure 1. Détails pour les échantillons d’ambre gris analysés. a) Carte montrant les localités où des échantillons d & apos; ambre gris ont été trouvés à l & apos; origine., (b) Photographies montrant une grande diversité des caractéristiques physiques des fragments d’ambre gris: TEXEL151212 (provenant de spécimens de baleine disséqués) était granuleux en consistance, tandis que les échantillons de jetsam semblaient superficiellement plus denses et hétérogènes, et étaient équigranulaires intérieurement et significativement plus pâles en couleur.
| échantillon | emplacement | masse totale (g) | masse analysée (mg) | % ambréine |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | ouest du Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Pays-bas | 83000 | 92 | 93 |
| exemple | le total des bénéfices lit | moyenne retenue lire longueur (bp) | total aligné lit (adnmt) | les temps de la couverture (adnmt) | total aligné lit (génome entier) | les temps de la couverture (génome entier) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
Une analyse de séquence a été effectuée sur l’installation de calcul haute performance de l’Université de Copenhague, avec des fichiers FASTQ traités à l’aide du pipeline PALEOMIX (v. 1.2.13) . FastQC v. 0.11.8 a été initialement utilisé pour le contrôle de la qualité des données de séquence brutes. Les adaptateurs ont été coupés en utilisant AdapterRemoval v. 2.3.1, avec des lectures inférieures à 25 pb également supprimées. Les lectures ont ensuite été mappées aux séquences de référence à l’aide de BWA , en appliquant également mapDamage2.,0 pour la quantification de base de la dégradation, produisant des alignements avec des séquences de référence. ANGSD a ensuite été utilisé pour produire des séquences au format FASTA.
L’incertitude entourant l’origine et les mécanismes biologiques de la production de l’ambre gris nous a incités à considérer plusieurs espèces possibles de cétacés et de pinnipèdes en analyse séquentielle. L’identité de l’espèce a été inférée en cartographiant le succès et la relation phylogénétique avec 19 espèces candidates de cétacés et de pinnipèdes dans NCBI RefSeq (voir le matériel supplémentaire électronique)., Ces espèces ont été sélectionnées en fonction de leur aptitude potentielle en tant que mammifères marins de plongée profonde remplissant une niche écologique similaire aux cachalots, afin d’exclure que ces espèces soient co-adaptées pour produire de l’ambre gris. Les séquences d’échantillons ont été concaténées et alignées à l’aide de MAFFT v. 7.392 . Des modèles d’arbres phylogénétiques ont ensuite été produits dans MEGA X en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance avec le modèle Hasegawa-Kishino–Yano , avec des distances estimées par l’approche du maximum de vraisemblance composite (les détails de toutes les séquences de référence utilisées sont inclus dans le matériel supplémentaire électronique).,
Résultats
Les analyses phylogénétiques ont confirmé sans équivoque l’origine des cachalots des quatre échantillons d’ambre gris (figure 2; matériel supplémentaire électronique, figure S1). De même, l’alignement avec le génome mitochondrial de référence Physeter macrocephalus de NCBI (NC_002503.2) a produit les résultats de couverture les plus élevés pour tous les échantillons de tous les alignements effectués et fournit une attribution sûre, mais avec des variations significatives de succès entre les échantillons. Le séquençage de l’échantillon d’un cachalot échoué (TEXEL151212) a produit de loin la couverture la plus élevée (env., 20×) pour les mitochondries de cachalot, alors qu’un des échantillons de jetsam de l’île Pitt (S. 01) n’a donné qu’une couverture d’environ 0,2× (voir tableau 2). Les alignements avec Kogia sima (cachalot nain) et Kogia breviceps (cachalot pygmée) génomes mitochondriaux de référence (NC_041303.1, NC_005272.1) ont également donné une couverture (détails dans le matériel supplémentaire électronique), bien que de nombreuses régions fonctionnelles hautement conservées soient partagées entre les espèces analysées, ce qui entraîne une similitude de séquence élevée . Cependant, la couverture pour les espèces de kogiidés était généralement d’environ un facteur 10 de moins que pour Physeter., L’alignement avec le génome de référence nucléaire entier de P. macrocephalus (ASM283717v2) a également été réussi, bien que cela soit plus évident dans les comparaisons du nombre total de lectures mappées au génome. L’alignement pour Architeuthis dux (calmar géant ), une proie commune réputée des cachalots (par exemple), a échoué, mais ce n’est pas leur proie prédominante .
la Figure 2. Maximum de vraisemblance arbre phylogénétique du modèle généré à partir de séquences de référence et aligné à l’exemple de génomes mitochondriaux., Les échantillons sont clairement regroupés avec le cachalot (P. macrocephalus) plutôt qu’avec le cachalot nain et pygmée (Kogia spp.). Cet arbre reflète le modèle de log-vraisemblance le plus élevé, les valeurs reflètent le pourcentage d’arbres calculés dans lesquels les taxons associés ont été regroupés, indiquant la confiance dans le positionnement, et les longueurs de branches mesurent le nombre de substitutions à chaque site (voir échelle). Figure produite en MEGA X. Description des baleines de: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Un arbre phylogénétique comprenant les 19 espèces candidates est présenté dans le matériel supplémentaire électronique, figure S1.
Les résultats de MapDamage montrent remarquablement peu de variation inter-échantillon affectant les transitions C à T aux extrémités du brin 5′, bien qu’un pourcentage plus élevé de transitions G à A à l’extrémité 3′ existe pour S. 01 (détails dans electronic supplementary material, figure S2), indiquant une possible dégradation biomoléculaire plus élevée., En général, cependant, très peu de modifications chimiques se sont produites, et la distribution des altérations entre les brins reste uniforme et plate.
Discussion
Cette étude a démontré que trois échantillons d’ambre gris jetsam peuvent être attribués avec confiance au cachalot par extraction d’ADN. Bien que la confirmation d’une origine de cachalot pour l’ambre gris jetsam ne soit pas un résultat surprenant, la présente étude est la première à fournir une preuve de concept significative dans la récupération de l’ADN endogène de l’ambre gris et son utilisation réussie pour l’identification des organismes., Il est important de noter que l’origine des trois échantillons de jetsam ambergris étudiés ici peut être identifiée en toute confiance comme un cachalot sur la base non seulement du succès de l’alignement génétique, mais aussi de la modélisation des génomes mitochondriaux dans des arbres de parenté phylogénétique, y compris pour un grand échantillon de taxons de mammifères marins hors groupe., Cependant, bien que tous les échantillons analysés ici aient été identifiés comme provenant de cachalots, il est tout à fait possible que d’autres mammifères marins de plongée profonde étroitement apparentés (tels que les cachalots nains et pygmées) produisent de l’ambre gris et n’ont tout simplement pas encore été enregistrés comme le faisant à ce jour.
La cause prédominante de la variation spectaculaire de la couverture génétique observée entre les échantillons n’est pas claire. Analyse de la dégradation de l’ADN dans mapDamage2.,0 montre peu de corrélation avec les couvertures d’alignement, comme on pourrait s’y attendre, et il y a également peu de variation entre la teneur en ambréine dans les échantillons qui pourrait contribuer à la préservation différentielle de l’ADN. L’âge précis des échantillons de jetsam actuels est inconnu, bien que des études antérieures aient réussi à dater au radiocarbone d’autres échantillons d’ambre gris . Toutefois, radiocarbone sortir ensemble des échantillons relativement récents est problématique en raison de l « impact des émissions de combustibles fossiles , et les dates de radiocarbone depuis l » augmentation de la libération de carbone anthropique ne sont pas fiables., Produire un taux de dégradation constant pour les transitions G à A dans des échantillons plus anciens datés de manière fiable pourrait, à l’avenir, aider à une meilleure compréhension des dommages différentiels à l’ADN. Une autre option pour de futures recherches pourrait être des études sur la désamidation de la glutamine et la racémisation de l’acide aspartique à partir de l’analyse de peptides organiques éventuellement également présents dans l’ambre gris . Alternativement, cependant, la variation intra-échantillon de l’ADN et de la concentration d’ambréine pourrait tout aussi probablement expliquer la faible couverture dans l’échantillon S.,01, alors que l’exposition plus récente au tissu de cachalot explique sans aucun doute la couverture élevée dans l’échantillon de baleine échouée TEXEL151212.
Le potentiel de conservation des précipités d’ambréine pour l’ADN s’étend non seulement à la génétique endogène des baleines, mais aussi à la couverture métagénomique du microbiome intestinal des baleines, et potentiellement aussi à l’ADN de leurs proies. Par exemple , l’ADN peut également rester dans des becs de calmars partiellement ou non digérés trouvés dans les fèces de cachalot , et dans l’ambre gris, qui sont même théorisés pour être une cause pathologique de la sécrétion d’ambre gris ., La compréhension de la composition procaryotique de l’environnement microbiologique de l’ambre gris pourrait également élucider davantage l’origine de l’ambre gris, en particulier dans la conversion du squalène en ambréine et le processus par lequel l’ambre gris semble se former dans les couches d’accrétion. D’autres analyses sur la récupération de l’ADN endogène de l’ambre gris de jetsam, y compris l’ADN du microbiote intestinal et des proies des baleines, permettraient de mieux comprendre l’écologie, l’évolution et le métabolisme des cachalots.,
Conclusion
L’ambre gris de Jetsam a longtemps été un matériau énigmatique, sujet à discussion et à analyses dans les publications scientifiques depuis le XVIIIe siècle . Cette étude est la première à notre connaissance à présenter une confirmation finale de l’origine biologique des échantillons d’ambre gris de jetsam en tant que cachalot, grâce à une analyse ADN. Au-delà, cependant, la présente étude expose le potentiel de l’ambre gris en tant que nouvelle source de données génétiques liées aux cachalots avec une longévité considérable dans le temps., Une plus grande élucidation reste à réaliser grâce à l’étude des conditions de conservation de l’ADN dans l’ambréine et des effets différentiels de multiples facteurs. Cependant, les implications potentielles pour faciliter notre compréhension de la dynamique des populations passées chez les baleines et de leurs taxons écologiquement associés pourraient être profondes. Les plus anciens ambergris connus trouvés dans les dépôts du Pléistocène présentent des becs de calmars perminéralisés contenant des acides aminés endogènes aux calmars, que les auteurs attribuent à la capacité de conservation des sédiments locaux ., Bien qu’il soit peu probable que l’ADN soit conservé pour un tel âge (1,75 Ma), cette découverte pourrait également être attribuable à l’efficacité de l’ambre gris et de l’ambréine comme substrats de conservation. Beaucoup de choses sont encore inconnues sur l’écologie et l’adaptation des géants marins autrefois caractérisés comme des bêtes semi-mythiques, et l’ambre gris peut maintenant s’avérer une clé petite mais significative pour comprendre certains autres aspects d’entre eux.
Ethique
Tous les échantillons ont été obtenus et analysés éthiquement dans cette étude, qui fait partie du projet DNRF-128 PROTEIOS., Des quatre échantillons d’ambre gris analysés dans cette étude, trois (S. 01–S. 03) ont été sous-échantillonnés à partir de matériaux étudiés par S. J. R. dans des publications antérieures (voir ci-dessus), obtenus sous forme d’ambre gris jetsam trouvé sur les plages (échantillons nos ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 et ACL237-S. 03). Le quatrième échantillon (TEXEL151212) a été gentiment fourni comme sous-échantillon du spécimen d’ambergris TEXEL151212 par le Dr A. Oosterbaan au nom du Musée EcoMare de Texel, aux Pays-Bas, où le reste de cet échantillon est toujours conservé. Nous sommes reconnaissants pour la permission du musée d’utiliser cet échantillon.,
l’accessibilité des Données
contributions des Auteurs
intérêts divergents
Nous déclarons que nous n’avons pas de conflit d’intérêts.
Financement
Le financement a été fourni par la subvention de la Fondation nationale danoise pour la Recherche PROTEIOS (DNRF128).
Remerciements
R. M. remercie le Dr J. A. Samaniego pour ses conseils sur les analyses génomiques, ainsi que M. McCarthy pour ses conseils et ses discussions. Nous sommes reconnaissants au Dr A. Oosterbaan (Ecomare Museum, Texel) pour l’échantillon S. 04 et aux collectionneurs anonymes pour les échantillons S. 01–S. 03., Les auteurs tiennent à remercier le Centre national danois de séquençage à Haut débit pour son aide à la génération de données Illumina.
Notes de bas de page
Des documents électroniques supplémentaires sont disponibles en ligne àhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
Publié par la Royal Society selon les termes de la Licence Creative Commons Attribution http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, qui permet une utilisation sans restriction, à condition que l’auteur original et la source soient crédités.