Kuva 1. Kolmen Valitun still-kuvia elokuvasta POLO-köyhdytettyä solut osoittavat selvästi, että, ajan kuluessa, voimakas sentromeeri/kinetochore signaali (punainen) ratkaisee osaksi pari pistettä, joka osoittaa, että kromosomit ovat syntelically kiinnitetty kara mikrotubuluksia (vihreä). 4D fluoresenssimikroskopiatiedot kerättiin 30 sekunnin välein 0.,5 mm z-vaiheet, jotka kattavat koko solun tilavuus käyttäen 100°, 1.4 NA suunnitelma-apochromatic tavoite 25°C: ssa, jossa Andor on Vallankumous, pyörivä levy confocal yksikkö ja iXon EMCCD-kamera, sekä ohjaa Andor IQ live-cell imaging-ohjelmisto.
mitoottinen solunjakautuminen perustuu solujen kykyyn jakaa kunnolla sisarkromatideja muodostaviin soluihin. Luotettavasti suorittaa toiminnon solut käyttävät sisäisen editointi mekanismeja korjaa virheellisiä kromosomi / kara kuitua liitetiedostoja., Pariksi kinetokorit ovat yleensä kohdistettu oikein kiinnitä kara kuituja ja erottaa chromatin, on kuitenkin virheellinen ja väärin kinetokorit tehdä tulosta. Solut sisältävät erikoistunut editointi mekanismeja ehkäistä ja korjata nämä vinossa kinetochore paria, vaikka tarkkaa mekanismia ei tunneta hyvin 1,2 ., On arveltu Tatiana Moutinho-Santos klo Universidade do Porto, Portugali Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC), että läsnäolo POLO-kinaasi on tarpeen edistää kromosomi bi-suuntautuminen (kutsutaan amphitelic järjestely) ja siten säilyttää oikea kinetochore linjaus.
ymmärtää paremmin sen rooli säätelyssä kinetochore kehityksen, Tohtori Moutinho dos Santos opiskeli köyhdytettyä Drosophila POLO kinaasi sisällä eläviä soluja perustelemaan POLO osallistuminen editointi toimintoja tarvitaan ylläpitämään amphitelic kinetochore järjestely., Tässä tapauksessa, syntelic järjestely (sisko kinetokorit kiinnitetty mikrotubulukset peräisin sama kara) oli tutkittu. Timelapse-analyysi mitoosin suoritettiin Drosophila S2 solujen vakaasti ilmaista CID-mCherry visualisointiin ja sentromeerien, ja GFP-a-tubuliinin varten mikrotubulukset. Visualisointi kinetokorit on vaativa, koska niiden pieni koko, alhainen fluoresoiva signaali ja lyhyt ulkonäkö solunjakautumisen aikana. Confocal fluoresenssi mikroskopia käytetään usein kuvan kinetokorit, kuitenkin, vaikka tässä ympäristössä, visualisointi on edelleen vaikeaa., Se kinetokorit ovat hyvin pieniä (300 nm)3, lähellä sivusuunnassa ratkaista valmiuksia valo mikroskoopin, ja ylittää mikroskooppi on aksiaalinen ratkaista kyky. Lisäksi elävissä soluissa olevat fluoresoivat merkkiaineet aiheuttavat potentiaalisia fototoksisia ja fotobleaching-vaikutuksia. Voimakas laservalaistus voi aiheuttaa fototoksisuusongelmia, erityisesti haitallisia eläville, jakautuville soluille.
Andor on Vallankumous XD spinning disk confocal mikroskopia on palkattu voittamaan Tohtori Moutinho dos Santo on ainutlaatuinen haaste liittyy havainto kinetokorit., Tässä tapauksessa, neljä erillistä tekijöitä on samanaikaisesti osoitettu riittävästi visualisoida dynaamisten soluprosessien:
- tuulen Nopeus ja hankinta
- Alueellinen ja ajallinen ratkaista valmiudet
- kyky havaita hyvin alhainen fluoresenssin intensiteetti tasoilla
- Johdon käytettävissä fluoresenssin signaali
Nämä teemat paikkatietojen, ajallinen ja intensiteetti päätöslauselman toistuvat usein fluoresenssi mikroskopia ja ovat usein ristiriidassa kokeiluja, joissa havainto solujen elinkelpoisuuden., Esimerkiksi, kauan kamera vastuut ja pitkiä aikoja korkean intensiteetin valaistus tuottaa fototoksisia vaikutuksia, jotka vahingoittavat tai tuhoavat eläviä soluja. Samanaikaisesti, kevyesti merkitty mikrorakenteet edellyttävät pitkäkestoista altistumista visualisoida, mutta voi vaikuttaa haitallisesti, valovalkaistuminen. Ongelman tiivistäminen on tarve yhdistää perinteinen kolmiulotteinen data ajan dataan. Lopuksi on edelleen tarpeen erottaa signaalin taustamelu ja outof-focus haze.
hankinnan nopeus on erityisen tärkeä tohtori Mountinho dos Santosille., Kontrolli S2-soluilla on noin 30 minuutin jakosykli. Hänen kokeissaan käytetyt Polon köyhdytetyt S2-solut osoittivat kuitenkin yli kahdeksan tunnin pidätysajan. Tallennus POLO köyhdytettyä solunjakautumisen edellyttää kokoelma välillä 7,200 ja 12000 kuvan sarjaa (kaksi fluorokromien kuvaamisen välein kolmekymmentä sekuntia yhden viisi tuntia, hankittu 0.5 micron aksiaalinen vaiheet jopa 20 vaiheet aksiaalinen kinetochore resoluutio)., Perinteiset fluoresenssi mikroskopia ja laser valaistus mahdollistaa sen enempää lempeä valaistus tarvittavat vaatimukset eikä nopeus hankinta täydellinen aika herkkä tehtävä. Esimerkiksi laser rasterointi perinteisessä konfokaalimikroskopiassa vaatii pidemmän ajan signaalin keräämiseen näytteestä. Spinning disk confocal järjestelmiä käytetään voittaa nämä perinteiset esteet ja paljastaa uusia oivalluksia molekyyli kinetochore editointi tekniikoita.,
Verrattuna perinteisiin widefield fluoresenssi järjestelmät, alueellinen erotuskyky spinning disk confocal on ylivoimainen sekä sivusuunnassa (x ja y) axial (z) mitat. Kautta jatkuva skannaus pinhole array, näytteitä voidaan tarkastella reaaliaikaisesti korkea kontrasti, joka tarjoaa selkeitä kuvia diffraktio raja mikroskoopin optiikka. Tämä mahdollistaa 3D-visualisoinnin ja ymmärryksen dynaamisesta kinetochore-käyttäytymisestä suhteessa karan mikrotubuluksiin., Kinetochore ja sentromeeri sivusuunnassa päätöslauselman 300 nm ja kara kuitua päätöslauselman 300-500 nm raportoitiin ja yksityiskohtainen Kuva A.
Intensiteetti Resoluutio
Visualisointiin fluoresoivasti merkitty kinetokorit liittyvät kunkin sentromeeri paikoissa ylimääräisiä vaatimuksia hankinta järjestelmä. Tutkimuksen kohteena olevat centromeerit ja kinetochoret näkyvät ensisijaisesti vain solunjakautumisen interfaasin aikana. Solujen läpi profaasissa, että sentromeerien on jo ratkaistu itsensä Drosophila on tyypillinen kaksitoista kromosomi paria., Toimitusjohtaja valon budjetti aikana pitkiä hankinta edellyttää, lempeä valaistus ja korkea resoluutio pystyy spinning disk tekniikoita. Pyörivän levyyksikön aukot tarjoavat nämä edut. Koska valo kiihottaa fluoroforeja vain silloin, kun aukko on olemassa, fototoksiset vaikutukset minimoidaan. Vaikka counterintuitive, vähentää valo budjetti ei tarkoita heikko, on vaikea tunnistaa esineitä. Intensiteettitarkkuutta lisätään spinning disk ’ s poissulkeminen Out of focus signaali ja myöhemmin signaalin vahvistus EMCCD kameran arkkitehtuuri., Tämä luo uusi mahdollisuus luoda suurempi kontrasti kuvia paljastaen kehittäminen ja yhdenmukaistaminen pistemäinen esineitä, kuten kinetokorit.
Johtopäätökset
käyttö spinning disk tekniikan Tohtori Mountinho dos Santos live cell sovellus johti tärkeä havainto. Ilman POLO-kinaasi, Drosophila solut olivat osoittaneet, ettei korjaavia mekanismeja tarpeen säilyttää amphitelic kromosomi järjestely., Läsnäolo POLO oli osoitettu tarjoavat oikean ympäristön oikea sentromeeri arkkitehtuuri, samalla kun varmistetaan oikea-kromosomi bi-suuntautuminen. Viljellyt Drosophila solujen käynnissä mitoosin ilman POLO kinaasi kromosomit kiinnitä kara kuidut syntelic suunta, eli sisko kinetokorit kiinnitetty mikrotubulukset, jotka tulevat yhden akselin napa.
Tämä päätelmä tehtiin huolellisen analyysin 4D fluoresenssi mikroskopia soluissa ilmaista fluoresoivasti merkitty sentromeeri/ kinetochore merkki ja mikrotubulukset. (Kuva 1).