Havainto
Paljon edistystä mikrobiologia on riippuvainen tutkimuksen ”puhtaat viljelmät.”Nämä ovat kulttuureja, jotka sisältävät vain yhden solun, mieluiten kulttuuri johdettu alkuperäisestä yhden solun., Alussa on kehittää menetelmiä luoda puhdas kulttuurit (1), on ollut monia esimerkkejä, joissa kulttuurit, jotka olivat aluksi pitää olla puhdasta sittemmin todettu sisältävän kaksi tyyppisiä mikrobeja. Joissakin tapauksissa, nämä tahaton monilajikalastusta kulttuurit ovat johtaneet merkittäviin läpimurtoihin, kuten löytö lajista vedyn siirto (2). Kuitenkin, kynnyksellä syvä sekvensointi teknologioiden, se voisi kohtuudella ennustaa, että huomaamatta epäpuhtaudet kulttuureissa ei enää olisi merkittävä huolenaihe.,
Geobacter sulfurreducens kanta PCA oli eristetty 1990-luvun puolivälissä käyttämällä standardin rikastamiseen ja eristäminen tekniikoita, jotka sisältyvät laimennus sukupuuttoon nestemäinen väliaine, jota seuraa toistuva raitoja sekä yksittäisiä pesäkkeitä agar-karkaistu medium (3). Tämä on klassinen strategia, jota opetetaan suosituimmissa mikrobiologian oppikirjoissa (4-6). Myöhemmin G. sulfurreducens-kanta DL1 saatiin eristettyjen PCA-pesäkkeiden ylimääräisellä uudelleenreakaamisella (7). Kehittämällä menetelmiä G. sulfurreducensin geneettiseen manipulointiin (7) ja sen genomin sekvensointiin (8), G., sulfurreducens tuli Geobacter lajien valinta tutkimuksen fysiologian ja romaani solunulkoisen electron siirto ominaisuuksia tämän ympäristön kannalta tärkeitä suvun (9). Ensimmäinen sekvensointi 16S rRNA-geenin kulttuuri (3), sekä genomin sekvensointi ensimmäinen 8-kertainen (8) ja sitten 80-kertainen (10, 11) kattavuus, osoitti, että kulttuuri sisälsi vain yksi kanta.,
yritetään adaptiivisesti kehittyä DL1 tuottaa enemmän virtaa, se oli ympätty osaksi biosähköisen järjestelmän grafiitti anodi valmis milloin mahdollinen (-400 mV vs. Ag/AgCl), jota pidetään lähellä alaraja, jossa nykyinen sukupolvi alkaen asetaatti olisi mahdollista (12). Anodibifilmistä saatu isolaatti, joka on nimetty G: ksi., sulfurreducens kanta KN400 (12), on ylivoimainen inokulaatti kanta tuottaa sähkövirtaa, ja tämä paremmuus johtuu ainakin osittain sen kykyyn tuottaa enemmän ”mikrobien nanolangoiksi,” sähköä johtava proteiinisäikeet, että näyttely metallinen-kuten sähkönjohtavuus (13, 14).
– Se oli alun perin olettaa, että kanta KN400 oli kertynyt yksi tai useampia mutaatioita, jotka parantaa sen valmiuksia solunulkoisen elektronin siirto., Tämä olisi analoginen valinta mutantti kantoja aikana mukautuva kehitys kanta DL1 varten electron vaihtaa muiden organismien (11) tai korkeampia Fe(III) oksidi vähentäminen (10). Kuitenkin, vertaileva genomiikka kävi ilmi, että genomin sekvenssi kanta KN400 sisälsi enemmän kuin 27,270 yhden nukleotidin polymorfismien (snp) (15). Kolmas geenien oli vähintään yhden nukleotidin polymorfismi, ja neljännes oli polymorfismi, joka vaikuttaa syntyvän proteiinin sekvenssi (15). Tyypillisten mutaationopeuksien perusteella 6.,3 × 10-9/bp per sukupolvi (16), kestäisi yli 1000 vuotta kerätä näin monta mutaatiota kanta DL1. Lisäksi, ei ole orthologs in DL1 kanta 139 open reading frames (ORFs) vuonna KN400 kantaa perimän, joista useimmat ovat useimmat liittyvät läheisesti geenien phylogenetically erilaisia organismeja (15).
Nämä seikat ja se, että ORFs ainutlaatuinen KN400 ei ole havaittu, kun rokote kulttuuri oli materialisoitunut (10, 11) johti hypoteesiin, että KN400 tuli bioelectrochemical järjestelmää epäpuhtauksilta., Tämän mahdollisuuden arvioimiseksi DL1-viljelmän puhtautta arvioitiin vielä suuremmalla herkkyydellä.
Molemmat DL1 ja KN400 sisältävät omcS, geeni ulkopinta sytokromi joka on yksi korkeimmista osuudet SNPs (36 SNPs/kb) välillä kantoja (15). Tämä geeni oli monistettu, että DL1 kulttuuria, joka oli ollut tapana rokottaa bioelectrochemical järjestelmä, ja PCR-tuotteet sekvensoitiin kanssa Illumina Hi-Seq-2000 (ks. Teksti S1, täydentävää materiaalia)., KN400-sekvenssi havaittiin, mikä viittaa siihen, että KN400 oli inokulaatissa, jota käytettiin anodivalintatutkimuksessa. Kuitenkin >107 laadukkaita sarjoja talteen, vain 286 olivat KN400 sekvenssit vs. 1,5 × 107 DL1 sekvenssit (Taulukko 1).
Teksti S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Tämä on avoimen pääsyn artiklan jaetaan ehtojen mukaisesti Creative Commons Nimeä-Eikaupallinen-Jaasamoin 3.0 Muokkaamaton-lisenssillä, joka mahdollistaa vapaan ei-kaupalliseen käyttöön, jakeluun, ja lisääntyminen tahansa mediassa, kunhan alkuperäinen tekijä ja lähde hyvitetään.,
- Näkymä-inline
- Näytä ponnahdusikkuna
Arvioi rasitusta KN400 runsaasti eri culturesa
Taulukko S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Tämä on Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3: n ehdoilla jaettu avoin artikkeli.,0 Muokkaamaton-lisenssillä, joka mahdollistaa vapaan ei-kaupalliseen käyttöön, jakeluun, ja lisääntyminen tahansa mediassa, kunhan alkuperäinen tekijä ja lähde hyvitetään.
suhteellinen runsaus KN400 kanta tässä sama kulttuuri oli edelleen arvioida kvantitatiivisen PCR (qPCR), jonka pohjamaali asettaa tietyn geenin löytyy vain KN400 (ks. Teksti S1 ja Taulukko S1, täydentävää materiaalia) ja pohjamaali asettaa, että havaittu sekä KN400 ja DL1 (ks. Taulukko S1, täydentävää materiaalia)., KN400 – spesifisen sekvenssin suhteellinen runsaus oli samanlainen kuin kn400 omcS-sekvenssien, jotka määritettiin sekvensointimenetelmällä (Taulukko 1). ATCC: hen talletetun PCA-kulttuurin sekvenssianalyysi ja qPCR-määritys paljastivat KN400: n läsnäolon samanlaisessa vähäisessä runsaudessa (Taulukko 1).
– Olemme yrittäneet poistaa harvinainen KN400 epäpuhtauksien päässä DL1 kulttuuri toistuva restreaking yksittäisiä pesäkkeitä kasvanut jähmettynyt asetaatti-fumarate medium (7), mutta KN400 kanta jatkoi edelleen alhaisella taajuudella yksittäisiä pesäkkeitä (Taulukko 1)., Kuitenkin kulttuuri, jossa KN400 voisi enää havaita oli saatu nestemäinen asetaatti-fumarate medium (katso Teksti-S1, täydentävää materiaalia), jossa suurin laimennus, joilla kasvu oli tehty useita peräkkäisiä kierroksia serial laimennus (Taulukko 1). Tämä osoittaa, että DL1 kanta ei vaadi harvinainen läsnäolo KN400 jotta kasvaa asetaatti-fumarate medium, josta tämä kulttuuri on säännöllisesti huollettu.
kun puhdasta KN400-ja KN400-vapaata DL1-viljelmää rokotettiin asetaattifumaraattiväliaineeksi yhtä paljon, DL1 outcompeted KN400 (Kuva., 1 A). Tämä on yhdenmukainen havainto, että kun kaksi kantoja kasvatettiin erikseen, DL1 kasvoi paljon nopeammin kuin KN400 (optinen tiheys aallonpituudella 600 nm 0,04 varten KN400 vs. 0.65 varten DL1 jälkeen 36 h inkuboinnin; ks. S2 lisämateriaalissa) samassa väliaineessa. Osuus KN400 jatkoi laskuaan kanssa peräkkäisen siirrot (1% ymppi), kunnes runsaasti KN400 oli verrattavissa siihen, että KUMPPANUUS-ja yhteistyösopimuksen ja DL1 varastossa kulttuureissa (ks. Teksti S1, täydentävää materiaalia). KN400 pysyi tällä alhaisella tasolla lisäsiirroilla (Kuva. 1 A).,
Kuva S2
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Tämä on avoimen pääsyn artiklan jaetaan ehtojen mukaisesti Creative Commons Nimeä-Eikaupallinen-Jaasamoin 3.0 Muokkaamaton-lisenssillä, joka mahdollistaa vapaan ei-kaupalliseen käyttöön, jakeluun, ja lisääntyminen tahansa mediassa, kunhan alkuperäinen tekijä ja lähde hyvitetään.,
Kasvu ja aktiivisuus kanta KN400 erilaisissa kasvuolosuhteissa. (a) Suhteellinen runsaus KN400 peräkkäisissä mid-log siirrot (1% ymppi) kulttuurin aloitetaan saman verran KN400 ja DL1. Tulokset ovat kolmikantaisten kulttuurien keinoja ja standardipoikkeamia. (b) Nykyinen tuotanto kun DL1 kulttuuri otettiin anodi kamari bioelectrochemical järjestelmä grafiitti anodi valmis klo -400 mV vs. Ag/AgCl. KN400 – vapaa kulttuuri ei tuottanut virtaa tähän aikaan., (c) Suhteellinen runsaus KN400 vuonna anodi biokalvot kun ensimmäinen rokote oli DL1 kulttuuri myöhemmin todetaan sisältävät myös KN400. Tulokset ovat kolmikantaisten kulttuurien keinoja ja standardipoikkeamia.
Toistuvista yrityksistä kasvaa KN400-ilmainen DL1 kulttuurin anodi valmis klo -400 mV olivat tuloksettomia. Kuitenkin, nykyinen oli helposti tuotettu toinen joukko kokeita, joissa DL1 kulttuuri sisältää KN400 toimi inokulaatti (Fig. 1 B)., A qPCR määritys uutettu DNA anodi biofilm ilmoitti, että 100% omcS sekvenssit olivat KN400 sisällä toinen siirto (Fig. 1c). Nämä tulokset ehdotti, että syy, miksi KN400 syntyi anodit oli, että DL1 rasitusta ei pysty kasvamaan alle asetetut ehdot. Ilman tätä epätavallinen selektiivinen paine, KN400 olisi jäänyt huomaamatta KUMPPANUUS-ja yhteistyösopimuksen ja DL1 kulttuurien jopa tällä hetkellä saatavilla seuraavan sukupolven sekvensointi menetelmät, jotka voivat teoriassa tarjota thousandsfold kattavuus genomin sekvensointi.,
tekijät, jotka vaikuttavat kannan KN400 pitkäkestoiseen pysyvyyteen erittäin alhaisella taajuudella DL1-viljelmässä, ovat edelleen mysteeri. Merkitystä fyysisesti eristämällä yksittäisiä soluja menetelmillä ehdottomampia kuin raitoja vankka keskipitkän luoda puhdas kulttuureissa on tunnustettu jo jonkin aikaa (17), ja yhä kehittyneempiä menetelmiä toteutuksessa kehitetään edelleen (18-23)., Kuitenkin, pinnoitus-menetelmiä, jotka ovat olleet käytössä jo yli 100 vuotta ja opetetaan jokainen mikrobiologian opiskelija vakiona menettelyt puhtaat viljelmät (4-6) ovat yleisimpiä. Esitetyt tulokset osoittavat, että ilman yksisoluiset eristäminen, arvoituksellinen epäpuhtaudet voivat selviytyä hyvin alhainen taajuus kulttuurien vuosikymmenten intensiivisen tutkimuksen ja voi paeta havaitseminen jopa kaikkein hienostunut sekvensointi menetelmät tällä hetkellä saatavilla.,
Kuva S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Tämä on avoimen pääsyn artiklan jaetaan ehtojen mukaisesti Creative Commons Nimeä-Eikaupallinen-Jaasamoin 3.0 Muokkaamaton-lisenssillä, joka mahdollistaa vapaan ei-kaupalliseen käyttöön, jakeluun, ja lisääntyminen tahansa mediassa, kunhan alkuperäinen tekijä ja lähde hyvitetään.,