3.1.2.2. HPLC
HPLC: llä käyttäen asetonitriiliä – tai heksaani-pohjainen mobiili vaiheiden avulla suora havaitseminen fosfolipidien ilman erillistä siivous raaka-uute, jolloin nämä menetelmät yksinkertainen ja nopea. Nämä menetelmät eivät kuitenkaan tehokkaasti erota eri inositolifosfolipidejä. Nakamura ym. (1989) ovat kehittäneet HPLC-menetelmän, joka analysoi erityisesti aivoissa olevia Ptdinejä ja PtdInsP2: ta., Tässä menetelmässä rasva-uute on ensimmäinen derivatisoidun 9-anthryldiazomethane tuottaa (9-anthryl) PtdInsP ja di(9-anthryl) PtdInsP2 ja sitten derivatisoidun näytteen on erotettu HPLC-UV havaitseminen 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn ja SM ei derivatisoidun tämän reagenssin ja, näin ollen, eivät häiritse määritystä (Yamada et al., 1988). Tämä menetelmä on herkempi kuin underivatized UV havaitseminen menetelmä analyysi inositoli fosfolipidejä.
Matala (1990) on kuvannut käyttö DEAE-selluloosan sarakkeet preparatiivinen HPLC aivojen lipidit., Aivojen fosfolipidien liuotetaan 50 ml: aan Liuotinta (kloroformi/metanoli/H2O, 20:9:1, vol.) ja levitetään selluloosakolonniin (DEAE-selluloosa, Sigma), joka pestään emäksellä ja hapolla neutraaliksi. Pesty DEAE-selluloosa pakataan lasikolonniin (2 cm × 38 cm), jossa on liuotinkestävät varusteet. Sarake on eluoidaan virtausnopeudella 100 ml/h 1 1 lineaarinen gradientti 100% Liuotin 100% Liuotin B (Liuotin sisältää 0,6 M ammonium-asetaatti) ja 13-15 ml jakeet kerätään ja analysoidaan fosforia (Kuva. 3.3).,
Kuva. 3.3. PtdInsPs: n eristäminen naudan aivoista deae-selluloosakolonnikromatografialla. Acid pestä metanoli-saostettu Murto-Folch oli eluoida on DEAE-selluloosan sarake, jossa kaltevuus of 100% Liuotin (kloroformi/mefhanol/H2O, 20:9:1, vol.) 100%: iin liuotin B (liuotin A sisältää 0,6 M ammoniumasetaattia) ja 13-15 ml: aan kerättyjä fraktioita. Jakeet määritettiin orgaanisen fosforin osalta. Levitetyn orgaanisen fosforin keskimääräinen talteenotto oli noin 90%., Elutuksen huippu murtoluvulla. Kaksikymmentäviisi oli toistettavissa, mutta sitä ei tunnistettu. Huippujen koostumus määritettiin TLC-analyysillä yhdistetyistä fraktioista. Huiput tunnistetaan kuvassa esitetyllä tavalla.
kopioitu levyltä Low (1990) kustantajan luvalla.
Vaihtoehtoisesti, Matala (1990) suorittaa kromatografisen askel preparatiivinen HPLC: llä käyttäen amino-sarakkeessa. Aivojen fosfolipidien liuotettiin 5 ml: aan Liuotinta ja olivat virtausnopeudella 2.,5 ml/min 10 mm × 250 mm amino-NP-sarakkeessa (5 µm pallomainen piidioksidi n-propylamine binded vaihe, IBM Välineitä, Danbury, CT), jossa on 4,5 mm × 50 mm vartija sarake tasapainotettu Liuottimella A. sarake on eluoitiin virtausnopeudella 2,5 ml/min 25 ml: lla Liuotinta, 125 ml gradient of 100% Liuotin 100% Liuotin B, ja 100 ml 100% Liuotin B; 5 ml jakeet kerätään. Yhdistetyt jakeet ovat keskittyneet säätämällä 18 ml Liuotinta ja fosfolipidejä uutettu. Orgaanisen fosforin keskimääräinen talteenotto on 80 prosenttia., Täydellinen erottaminen PtdIns (90 ml), PtdInsP (150 ml) ja PtdInsP2 (160-200 ml) oli saatu (kromatogrammi ei kuvassa). Ptdinit ovat kuitenkin päällekkäisiä Ptdserin kanssa. Huippujen koostumus määritettiin yhdistettyjen fraktioiden TLC: llä.
Matala (1990) on myös kuvattu HPLC puhdistus -merkitty PtdIns(4)P ja PtdIns(4,5)P2 ihmisen verihiutaleita. Rasva-ote verihiutaleiden oli valmistettu 60 ml tuoretta ihmisverta läsnä metanoli saostetaan naudan aivojen PtdInsPs harjoittaja, on vihdoin redissolved 0.,5 1 Liuotinta ja virtausnopeudella 1 ml/min 4,5 mm × 250 mm amino-NP sarake tasapainotettu Liuotin A. sarake on eluoitiin 5 ml Liuotinta (25 ml lineaarinen gradientti 100% Liuotin 100% Liuotin B) ja 20 ml Liuotinta B. Yksi millilitra jakeet kerätään ja radioaktiivisuus määritettiin nestetuikelaskennalla. Käytetyn radioaktiivisuuden keskimääräinen talteenotto on noin 70%. On erinomainen resoluutio kolmen inositolifosfatidien mutta PtdIns päällekkäisyyksiä PtdOH., Siksi tämä HPLC-menettely ei ole sopiva valmistelua PtdIns koska PtdOH, joka useimmissa solutyypeissä on enemmän nopeasti merkitty Pi, ei ratkaista sitä. On todennäköistä, että muut anioniset fosfolipidejä, kuten PtdSer on huonosti ratkaistu alkaen PtdIns, jonka amino-NP sarake, kuten on havaittu DEAE-selluloosan menettely.
Kuten edellä, mikään edellä mainituista menetelmistä on tehokas in erottaa yksittäisiä PtdInsPs puhtaassa muodossa raakaöljystä kudoksen otteita. Siksi rasvauutteet on käsiteltävä useilla kromatografisilla vaiheilla., Tätä varten ote on ensin altistetaan Sephadex kromatografia erottaminen lipidien päässä nonlipids ote. Tämän jälkeen rasvafraktio kaadetaan DEAE-kolonniin, joka eluoidaan eri liuottimilla. Se PtdInsPs ovat talteen eluointi kanssa kloroformi/metanoli/ammonium-suolaa kuin lopullinen eluointi vaihe. Yksittäiset jakeet ovat keskittyneet 100 µl 45°C alle typen ja sitten konsentroitu jäännös on edelleen erotettu kasetti-sarake chromatography, TLC, HPLC-tai muut kromatografiset menettelyjä.,
Singh (1992) on kuvannut louhinta ja analyysi PtdIns, PtdIns(4)P ja PtdIns(4,5)P2 käyttäen Sep-Pak-kasetti. A total lipid extract (Folch et al., 1957) rotan aivojen synaptosomes ja mikroverisuonten oli ensimmäinen valmis ja ensimmäinen osa syntyy (Osa 1) on kerätty ja edelleen uutettu erillinen fosfolipidejä ja glycolipids kuvattu Dugan ym. (1986). Fosfolipidin osa oli joutunut DEAE-selluloosan kromatografia (irtautuminen 4) kuvailema Rouser et al. (1969) puhdistaa edelleen inositolin lipidit., Puhdistettu uute siirrettiin Sep-Pak-kasetti. Eri inositoli lipidit ovat eluoitiin pylväästä, jossa on lineaarinen gradientti ammoniumasetaattia ja vettä 0,5% ammonium-asetaatti (200 mM) ja 99,5% vettä ja 75% ammonium-asetaatti ja 25% vettä 60 min virtausnopeudella 0,5 ml/min (ks. Luku 2). Sarake eluaatti 120 min kerättiin 1 ml jakeet. Eri huiput tunnistettiin käyttämällä PtdIns, PtdIns(4)P ja PtdIns(4,5)P2 huiput viitekohtana., Yksittäisiä inositolipidejä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja analysoitiin HPLC: llä Geurts van Kessel et al: n kuvauksen mukaisesti. (1977). Yksittäiset fosfolipidit havaittiin 206 nm käyttämällä diode array detector ohjelmoitu skannata 200-350 nm välillä. Singh (1992) on osoittanut 50-90%: n palautuneen Ptdiineistä ja Inspeistä aivonäytteistä. InsP3 ja InsP4 näytteillä alin hyödyntämistä, koska huono määrällisesti pikemminkin kuin huono louhinta menetelmä. Sylinteriampullin menetelmiä ei ole sovellettu Ptdinsin(3)P: n, Ptdinsin(3,4)P2: n ja Ptdinsin (3,4,5)P3: n eristämiseen.
Cronholm ym., (1992) ovat kuvailleet Ptdinspien eristyneisyyttä rotan haimasta. Jokainen haima oli heti homogenoitu 3 ml kloroformi/metanoli (1:2, v/v), ja noin 3 MBq 3H-leimattu PtdIns(4)P tai PtdIns(4,5)P2 lisättiin yhdessä 0.6 ml 1.2 aq. HCl ennen uuttamista kloroformilla, kuten Schacht kuvaili (1981). Yhdistettyihin ja pestyihin uutteisiin lisättiin metanolia kloroformin / metanolin tuottamiseksi (3: 2, v/v). Ratkaisu oli sovellettu Lipidex-DEAE-sarakkeessa, ja suurin osa lipidit olivat eluoitiin kanssa kloroformi/metanoli (3:2, v/v) tai kloroformi/metanoli/vesi (3:6:1 vol.)., PtdIns ja PtdSer eluoitiin yhdessä 0,03 M H3PO4: n ja tunnistamattoman materiaalin kanssa 0,1 M H3PO4: llä. PtdIns(4)P oli eluoitiin 0,25 M H3PO4 ja PtdIns(4,5)P2 0,5 M H3PO4 kuten eluoitiin radioaktiivisuus. Kaikki jakeet uutettiin 0,4 ml: lla vettä/ml eluaattia. Ylempi vaihe otettiin takaisin 0,1 vol. kloroformia. Yhdistetyt kloroformifaasit pestiin 0,4 tilavuudella. 0,5 m HCl 50% aq: ssa. metanoli. Fraktioita käytettiin molekyylilajien määrittämiseen FAB/MS-menetelmällä (KS.jäljempänä).
Gunnarsson ym., (1997) käyttää normaali vaihe HPLC kanssa haihtumispäästöjen valon sironnan tunnistus analyysi kaupallisia näytteitä PtdInsPs yhdessä muiden fosfolipidejä. Käyttäen lineaarista gradienttia a, kloroformia / metanolia / ammoniakkia (50: 45: 3, vol.) ja B, kloroformi/metanoli/vesi/ammoniakki (25:55:17:3, vol.) saadaan hyvin ratkaistut myöhäiset nousupiikit Ptdinsille (4)P ja Ptdinsille(4,5) P2. Annos-vaste käyrät PtdIns(4)P ja PtdIns(4,5)P2 ei ollut lineaarinen, joka on ominaista light scattering detector (tuloksia ei esitetty)., Useimpiin tarkoituksiin HPLC-tekniikka on ylivoimainen tarkkuus, nopeus ja yleistä mukavuutta DEAE-selluloosan menettely ja on paras menetelmä, jos HPLC-laitteet on käytettävissä. DEAE-selluloosa on halpaa ja laajamittainen puhdistus saattaa vaatia tämän materiaalin käyttöä. HPLC-menettely on myös parempi kuin joissakin tai kaikissa suhteissa vaihtoehtoisia menettelyjä puhdistamiseksi polyphosphoinositides, esim. valmentavaan TLC tai neomysiinille affiniteetti kromatografia.