Johdanto
Ambra, tunnettu luonnollinen tuote kaskelotti , on myös löydetty jetsam rannoilla ympäri maailmaa , ja on erittäin arvostettu sen hyödyllisyys hajuvesiteollisuuden . Vaikka se on jo pitkään todettu, että jetsam ambra kerätään rannoilla on peräisin kaskelotteja , vähän tai ei lainkaan näyttöä tästä ei koskaan julkaistu, ja erot välillä, kuten näytteitä ja näytteitä ambra otettu suoraan kaskelotteja., Esimerkiksi, liero, ambra näytteet sisältävät yleensä paljon suurempi mittasuhteet triterpenoid alkoholin ambrein ja paljon pienempi mittasuhteet sterolit kuin näytteitä ambra alkaen kaskelotteja . Toisaalta, vaikka, liero, ambra joskus se sisältää fragmentteja kalmari nokat , ja koska pääjalkaiset, kuten kalmari, ovat merkittävä ravinnon osa siittiöiden valaita, tämä on mainittu osoitus alkuperästä jetsam coproliths alkaen kaskelotteja. Se on jopa teoria, ambra voi olla peräisin kuin patologinen eritystä ärsyttävä kova kalmari nokka kitiini ., Kuitenkin, muita meren nisäkäs lajeja (esim. jäsenten Globicephala ja Ziphiidae) myös saalistavat kalmareita , ja jotkut (kuten kääpiö ja kääpiö siittiöiden valaita) on myös mainittu mahdollisista lähteistä ambra . Siksi, edelleen selventää alkuperä jetsam ambra, me analysoidaan DNA: ta on ambra näyte kerätään sperma valas rantautui Alankomaissa ja sitä verrattiin DNA-sekvenssit eristetty jetsam ambra kerätty rannoille Uuden-Seelannin ja Sri Lankan.,
Ambra pidetään pääasiassa koostuu ambrein, koska sen tuotanto skvaleenia, yhteinen aineenvaihdunnan tuote monille eliöille . Tämä prosessi voi olla aiheuttama suoliston mikrobien vaikutus, ja saostuu tiheä, kiinteä massat sisällä valas paksusuolen . Se coprolitic kerääntymien, että tulos on koostumukseltaan hyvin sopii säilyttää DNA: n päässä colon-koska ambrein on hydrofobinen ja ilmeisesti kestävät hajoamista sisällä hapan suolisto-ympäristössä., Todisteita radiohiili dating varmasti osoittaa, vastustuskyky mikrobien ja valokuva-hajoaminen vesistöissä jopa vuosituhannen joissakin jetsam ambra näytteitä . Me arveltu, että tällainen materiaali voisi tarjota otollinen välimuisti on säilyttää DNA, vaikka pitkäaikainen altistuminen haitallisia olosuhteissa merellä.
aineisto ja menetelmät
Liero, ambra yksilöitä alkaen Pohjois Meren, Intian Valtameren ja Tyynenmeren analysoitiin, mikä materiaali on maailmanlaajuinen jakelu ., Kolme Jetsam ambergris-näytettä (Yksi Sri Lankasta, kaksi Pittin saarelta Uudesta-Seelannista) laskettiin talteen DNA: n talteenottoa varten. Neljäs näyte on peräisin leikkelyn miesten siittiöiden valas rantautui vuonna joulukuuta 2012 klo Razende Bol lähellä Texel, Alankomaat. Jälkimmäinen ”tuore” ambra, mistä vahvisti kaskelotin ruho, jos tiedossa verrattuna jetsam yksilöiden epävirallinen biologinen historia. Aiemmissa tutkimuksissa on saatu ja analysoitu ambriininäytteitä ja ulosteiden sterolipitoisuuksia .,
DNA: n eristys ja sekvensointi tehtiin GLOBE-Instituutti, Kööpenhaminan Yliopisto, on omistettu antiikin DNA-laboratoriossa seuraavat tiukat menettelyt minimointi saastuminen. Noin 120 mg oli subsampled (kuva 1 ja taulukko 1) DNA: n uuttoa. Näytteitä inkuboitiin 400 µl: n proteinaasi K-pitoisessa puskurissa Gilbert et al: n jälkeen. 56 ° C: ssa 10 tunnin ajan, minkä jälkeen supernatantit hoidettiin fenoli–kloroformivaiheen avulla carøe et al., ja puhdistettiin käyttäen Hallitsija DNA Siivous Sarakkeet (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) mukaan valmistajan ohjeita. Double-stranded kirjastot olivat rakennettu DNA-uutteita seuraavista PARAS protokolla , joka on suunniteltu ja todistettu nimenomaan sekvensointi antiikin ja hajonnutta DNA: ta. Kirjastot olivat täydennetty ja indeksoitu kautta PCR: llä käyttäen PfuTurbo Cx Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeita., Tuotteet olivat koottuja ekvimolaariset pitoisuus ennen sekvensointi on Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA) alustan, käyttäen 80 bp single end lukea kemiaa tanskan Kansallisen suurikapasiteettisten DNA-Sekvensointi-Keskus, Kööpenhamina, Tanska.
Kuva 1. Yksityiskohtaiset tiedot analysoiduista ambergris-näytteistä. a) kartta, jossa esitetään paikkakunnat, joista ambergriksen näytteet alun perin löydettiin., (b) Valokuvia osoittaa korkea monimuotoisuus fyysiset ominaisuudet ambra palasia: TEXEL151212 (mistä leikellään valas näyte) oli rakeinen johdonmukaisuus, mutta jetsam näytteitä pinnallisesti ilmestyi enemmän tiheä ja heterogeeninen, ja olivat sisäisesti equigranular ja huomattavasti vaaleampi väri.
| näyte | sijainti | kokonaismassa (g) | analysoidaan massa (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Saari, Uusi-Seelanti | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | länsi-Sri Lankassa | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Alankomaat | 83000 | 92 | 93 |
| näyte | yhteensä kertyneet lukee | keskimääräinen säilytti lukea pituus (bp) | yhteensä linjassa lukee (mtDNA) | kertaa kattavuus (mtDNA) | yhteensä linjassa lukee (koko genomin) | kertaa kattavuus (koko genomin) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
Sarja-analyysi toteutettiin high-performance computing laitos, Kööpenhaminan Yliopisto, ja FASTQ tiedostoja käsitellään käyttäen PALEOMIX putki (v. 1.2.13) . FastQC v. 0.11.8: aa käytettiin aluksi raakasekvenssitietojen laadunvalvontaan. Adapterit trimmattiin AdapterRemoval v. 2.3.1: llä , jolloin myös alle 25 bp poistettiin. Reads sitten kartoitettiin viittaussarjoja käyttäen BWA, myös soveltamalla mapDamage2.,0 perus hajoaminen kvantifiointi, tuottaa linjaukset viittaukset sekvenssit. ANGSD: tä käytettiin tämän jälkeen sekvenssien tuottamiseen FASTA-muodossa.
Epävarmuus alkuperän ja biologiset mekanismit tuotantoon ambra sai meidät harkitsemaan useita mahdollisia ehdokas valaiden ja pinniped lajin sekvenssin analyysi. Laji-identiteetti päätellä kartoittamalla menestys ja fylogeneettinen suhde 19 valaiden ja pinniped ehdokas lajien NCBI RefSeq (ks. sähköinen oheismateriaali)., Nämä lajit valittiin sillä perusteella, että mahdollinen soveltuvuus kuten syvä-sukellus meren nisäkkäät täyttö samanlainen ekologinen niche kaskelotteja, sulkea pois tällaisia lajeja on yhteistyössä sovitettu tuottamaan ambra. Näytesekvenssit koottiin ja linjattiin MAFFT v. 7.392: n avulla . Fylogeneettinen puu mallit olivat sitten tuotettu MEGA X käyttää maksimi-todennäköisyyden menetelmää kanssa Hasegawa–Kishino–Yano malli , jossa etäisyydet arvioitu enintään composite todennäköisyys lähestymistapa (tiedot kaikista viite sekvenssejä käytetään sisältyvät sähköinen oheismateriaali).,
Tuloksia
fylogeneettisten analyysien yksiselitteisesti tukivat kaskelotti alkuperä neljä ambra näytteitä (kuva 2; sähköinen oheismateriaali, kuva S1). Samoin yhdenmukaistaminen Physeter macrocephalus mitokondrioiden viite genomin alkaen NCBI (NC_002503.2) valmistettu korkein kattavuus tulokset kaikki näytteet kaikista linjaukset tehty ja tarjoaa varma nimeä, vaikka merkittäviä eroja menestys näytteiden välillä. Näytteen sekvensointi säikeisestä kaskelotti (TEXEL151212) tuotettu ylivoimaisesti suurin kattavuus (n., 20×) siittiöiden valas mitochondrion, kun yksi jetsam näytteet Pitt Island (S. 01) vain tuotti noin 0,2× kattavuus (ks. taulukko 2). Linjaukset Kogia sima (kääpiö kaskelotti) ja Kogia breviceps (kääpiö kaskelotti) viite mitokondrioiden genomit (NC_041303.1, NC_005272.1) myös tuottanut kattavuus (lisätietoja sähköisessä oheismateriaali), vaikka monet erittäin säilytetty toiminnalliset alueet on jaettu analysoida lajeja, jolloin korkea sekvenssin samankaltaisuutta . Kogiidilajeilla peitto oli kuitenkin tyypillisesti noin 10-kertainen vähemmän kuin fysikaalisella., Yhdenmukaistaminen P. macrocephalus koko ydinvoima viite genomin (ASM283717v2) oli myös onnistunut, vaikka tämä on selvemmin vertailuja kokonaismäärä lukee kartoitettu genomi. Linjaus Architeuthis dux (jättiläiskalmari ), tunnettu yhteinen saalis kaskelotit (esim.), ei onnistunut, mutta tämä ei ole niiden hallitseva saalis.
Kuva 2. Maksimi-todennäköisyys, fylogeneettinen puu malli on luotu viite-sekvenssit ja kohdistettu näyte mitokondrioiden genomeja., Näytteet sijaitsevat selvästi kaskelotin (P. macrocephalus) ryhmittelynä kääpiövalaiden (Kogia spp.). Tämä puu heijastaa korkein log-todennäköisyys malli, arvot heijastavat prosenttiosuus puut lasketaan joka liittyy taksonit olivat ryhmittyneet, mikä osoittaa luottamusta paikannus, ja sivuliikkeen pituudet mitataan useita vaihtoja kunkin sivuston (ks. asteikko). Kuva tuotettu MEGA X . Whale depoctions from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Fylogeneettinen puu, joka sisältää kaikki 19 ehdokaslajia, esitetään sähköisessä lisäaineistossa, kuva S1.
Tulokset MapDamage näyttää huomattavan vähän inter-näytteen vaihtelu vaikuttaa C-T siirtymät 5′ säie päättyy, vaikka suurempi osuus G-A siirtymiä 3′ end on olemassa S. 01 (lisätietoja sähköisessä oheismateriaali, kuva S2), mikä osoittaa mahdollisia suurempi biomolekyylitason hajoamista., Yleensä kemiallisia muutoksia on kuitenkin tapahtunut hyvin vähän, ja muutosten jakautuminen säikeisiin pysyy yhtenäisenä ja tasaisena.
Keskustelua
Tämä tutkimus on osoittanut, että kolme jetsam ambra näytteitä voi varmuudella johtua kaskelotti läpi DNA: n eristämistä. Kun vahvistus kaskelotti alkuperä jetsam ambra ei ole yllättävä tulos, nykyinen tutkimus on ensimmäinen tarjota merkittäviä proof-of-concept hakemisessa endogeenisen DNA: ambra ja onnistuneesti käyttää sitä organismin tunnistetiedot., Tärkeintä, alkuperä kaikki kolme jetsam ambra näytteitä tutkittu tässä voi varmuudella tunnistettu kaskelotti perusteella ole vain geneettinen linjaus menestystä, mutta myös mallintaminen mitokondrioiden genomit vuonna fylogeneettiseen sukulaisuuden puita, mukaan lukien suuri otos outgroup merinisäkkäiden taksonien., Kuitenkin, vaikka kaikki näytteet analysoitiin täällä havaittiin olevan peräisin kaskelotti, se on silti täysin mahdollista, että muut läheisesti syvä-sukellus meren nisäkkäiden (kuten kääpiö ja kääpiö siittiöiden valaita) saattaa tuottaa ambra ja on yksinkertaisesti vielä ole kirjattu näin tasalla.
suurin syy näytteiden välillä havaittuun geneettisen kattavuuden dramaattiseen vaihteluun on epäselvä. Analyysi DNA: n hajoamisesta mapdamageessa2.,0 näyttää vähän korrelaatio linjaus coverages, kuten voisi olettaa, ja siellä on myös vähän vaihtelua välillä ambrein sisältöä näytteitä, joka voisi olla odotettavissa edistää ero DNA: n säilyttäminen. Nykyisten jetsam-näytteiden tarkkaa ikää ei tiedetä, vaikka aiemmissa tutkimuksissa on onnistuneesti radiohiiliajoitettu muita ambergris-näytteitä. Suhteellisen tuoreiden näytteiden radiohiiliajoitus on kuitenkin ongelmallinen fossiilisten polttoaineiden päästöjen vaikutuksen vuoksi, ja radiohiiliajoitukset ihmisen hiilidioksidipäästöjen lisääntymisen jälkeen ovat epäluotettavia., Tuottaa johdonmukaista, että hajoaminen G A siirtymiä luotettavasti päivätty vanhempia näytteitä voisi tulevaisuudessa tukea paremmin, ero DNA-vaurioita. Toinen vaihtoehto tulevalle tutkimukselle voisi olla tutkimukset glutamiinin deamidaatiosta ja asparagiinihapon rasemisaatiosta orgaanisten peptidien analysoinnista mahdollisesti myös ambrissa. Vaihtoehtoisesti, kuitenkin, intra-näytteen vaihtelu DNA: n ja ambrein keskittyminen saattaa aivan yhtä todennäköisesti osuus on alhainen kattavuus näyte S.,01, vaikka uudemmat altistuminen kaskelotti kudos epäilemättä selittää korkea kattavuus beached valas näyte TEXEL151212.
preservational potentiaalia ambrein saostuu DNA ulottuu ei vain endogeenisen valas genetiikka, mutta myös metagenomic kattavuus valas gut microbiome, ja mahdollisesti myös DNA saaliinsa. Esimerkiksi DNA: ta voi myös pysyvät osittain tai undigested kalmari nokat löytyy kaskelotti ulosteet , ja ambra , jotka ovat jopa teorian olevan patologinen syy ambra eritystä ., Ymmärtää prokaryootti-koostumus microbiome ympäristön ambra voisi myös edelleen selventää alkuperä ambra, erityisesti muuntaminen skvaleenia, jotta ambrein ja prosessi, jonka ambra näyttää muodossa kerroksia vesijättö. Lisäksi analyysit endogeenisen DNA-haku alkaen jetsam ambra, kuten myös DNA: n päässä valas suoliston mikrobiston ja saalista, tuottaa merkittävästi enemmän oivalluksia kaskelotti ekologia, evoluutio ja aineenvaihduntaa.,
Johtopäätös
Liero, ambra on pitkään ollut arvoituksellinen materiaalia, keskustella ja analyysit tieteelliset julkaisut vuodesta kahdeksastoista-luvulla . Tämä tutkimus on ensimmäinen tietomme esittää lopullisen vahvistuksen biologinen alkuperä jetsam ambra näytteiden siittiöiden valaita, DNA-analyysi. Tämän lisäksi tässä tutkimuksessa esitetään mahdollinen ambra kuin uusi lähde geneettiset tiedot, jotka liittyvät kaskelotteja huomattavan pitkäikäisyys koko ajan., Suurempi selvittäminen jää saavutetaan tutkimuksen preservational ehtoja DNA ambrein ja differential vaikutukset useita tekijöitä. Kuitenkin mahdollisia vaikutuksia avunannosta ymmärrystämme menneisyyden populaatiodynamiikkaan valaita ja niiden ekologisesti liittyvät taksonien voi olla syvällinen. Vanhin tunnettu ambra sijaitsee Pleistoseeni talletukset ominaisuus permineralized kalmari nokat sisältävien aminohappojen endogeenisen kalmari, joissa kirjoittajat määrite preservational kapasiteetti paikallisen sedimentti ., Vaikka se on epätodennäköistä, että DNA on säilynyt tällaisen ikä (1.75 Ma), tämä havainto saattaa myös johtua tehokkuutta ambra ja ambrein kuin preservational alustoille. Paljon on vielä tuntematon noin ekologia ja mukauttaminen meren jättiläisiä aiemmin luonnehtia semi-myyttinen eläimet, ja ambra voi nyt todistaa, että pieni, mutta merkittävä avain ymmärtää joitakin kohtia niistä.
Etiikka
Kaikki näytteet saatiin ja analysoitiin eettisesti tässä tutkimuksessa, osa DNRF-128 PROTEIOS hanke., Neljä ambra näytteet analysoidaan tässä tutkimuksessa, kolme (S. 01–S. 03) olivat subsampled materiaalista tutkittu S. J. R. aiemmissa julkaisuissa (ks. edellä), saadaan jetsam ambra löytyy rantoja (näyte nro ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 ja ACL237-S. 03). Neljäs näyte (TEXEL151212) oli ystävällisesti kuin osanäyte ambra näyte TEXEL151212 Tohtori A. Oosterbaan puolesta EcoMare Museo, Texel, Alankomaat, missä muualla tämä näyte on edelleen pidetään. Olemme kiitollisia museon luvasta käyttää tätä näytettä.,
Tietojen saatavuutta
Kirjoittajien osuudet
Kilpailevat edut
Me julistamme, että meillä ei ole kilpailevia etuja.
Rahoitus
Rahoitus oli esittänyt tanskan Kansallinen tutkimussäätiö myöntää PROTEIOS (DNRF128).
Kiitokset
R. M. on kiitollinen Tohtori J. A. Samaniego neuvoja genomista analyysit, ja myös M. McCarthy neuvoja ja keskusteluja. Olemme kiitollisia Tohtori A. Oosterbaan (Ecomare Museo, Texel) näytteen S. 04 ja anonyymi keräilijöiden näytteitä S. 01–S. 03., Tekijät haluavat kiittää avusta, tanskan Kansallinen High-Throughput Sequencing-Keskuksen Illumina tietojen tuottamista.
Alaviitteet
Sähköinen täydentävä aineisto on saatavilla verkossa osoitteessa https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
julkaisija Royal Society ehtojen mukaisesti Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, joka sallii vapaan käytön, kunhan alkuperäinen tekijä ja lähde hyvitetään.