Maa on koti miljoonia bakteeri-lajeja, joista jokaisella on ainutlaatuisia ominaisuuksia. Näiden lajien tunnistaminen on tärkeää ympäristönäytteiden arvioinnissa. Lääkäreiden on myös erotettava erilaiset bakteerilajit tartunnan saaneiden potilaiden diagnosoimiseksi.
tunnistaa bakteerit, erilaisia tekniikoita voidaan käyttää, mukaan lukien mikroskooppinen havainto morfologia tai kasvun erityinen media tarkkailla pesäkemorfologia., Geenianalyysi, toinen menetelmä bakteerien tunnistamiseksi on kasvattanut suosiotaan viime vuosina osittain ribosomaalisen RNA-geenin sekvensoinnin vuoksi.
bakteerien ribosomi on kahdesta alayksiköstä koostuva proteiini-RNA-kompleksi. 30S alayksikköön, pienempi näistä kahdesta alayksiköstä, sisältää 16S rRNA, joka on koodattu 16S rRNA-geenin sisällä genomista DNA: ta. 16S rRNA: n erityisalueet ovat erittäin suojattuja, koska ne ovat välttämättömiä ribosomin kokoonpanossa. Muut alueet, jotka ovat vähemmän kriittisiä toiminnan kannalta, voivat vaihdella bakteerilajien välillä., Muuttuva alueet 16S rRNA, voi toimia ainutlaatuinen molekyylien sormenjäljet bakteerilajien, jolloin voimme erottaa fenotyyppisesti identtisiä kantoja.
saatuaan laatu näyte gDNA, PCR 16S rRNA-koodaus geeni voi alkaa. PCR on yleisesti käytetty molekyylibiologian menetelmä, joka koostuu denaturaatio kaksinkertaisen-pulaan DNA-malli, hehkutus universal primer paria, joka täydentää erittäin konservoituneita alueita geeni, ja laajentaminen alukkeet DNA-polymeraasi., Vaikka jotkut alukkeet vahvistavat suurimman osan 16S rRNA koodaus geeni, toiset vain vahvistavat fragmentteja siitä. PCR: n jälkeen tuotteet voidaan analysoida agaroosigeelielektroforeesilla. Jos vahvistus onnistui, geeli pitäisi olla yksi bändi on odotettu koko, riippuen alukepari käyttää, jopa 1500bp, likimääräinen pituus 16S rRNA-geeni.
sen Jälkeen, kun puhdistus ja sekvensointi, saadut sekvenssit voidaan sitten tuli RÄJÄHDYS tietokantaan, jossa niitä voidaan verrata viite-16S rRNA-sekvenssit., Koska tämä tietokanta palauttaa vastaavat perustuu korkeimpaan samankaltaisuus, tämä mahdollistaa vahvistuksen henkilöllisyyden bakteerien kiinnostusta. Tässä videossa, voit tarkkailla 16s rRNA geeni sekvensointi, mukaan lukien PCR, DNA sekvenssi analyysi ja editointi, sekvenssi kokoonpano ja tietokanta haku.
mikro-organismeja käsiteltäessä on tärkeää noudattaa hyvää mikrobiologista käytäntöä, mukaan lukien aseptisen tekniikan käyttö ja asianmukaisten henkilönsuojainten käyttö. Suorittamisen jälkeen asianmukaisen riskinarvioinnin mikro-organismi tai ympäristön näyte kiinnostusta, saada testi kulttuuria., Tässä esimerkissä käytetään puhdasta Bacillus subtilis-viljelmää.
aloita viljelemällä mikro-organismiasi sopivalla välineellä sopivissa olosuhteissa. Tässä esimerkki, Bacillus subtilis 168 on kasvanut LB-liemi yön yli ravistamalla yrityshautomo asetettu 200 rpm 37 astetta. Seuraavaksi käytä kaupallisesti saatavilla pakki eristettyä genomista DNA: ta tai gDNA 1,5 millilitraa B. subtilis yössä kulttuuria.
Voit tarkistaa laadun eristetty DNA, ensimmäinen sekoita viisi mikrolitraa eristetty gDNA yksi mikrolitra DNA gel loading dye. Sitten, lataa näyte päälle 0.,8-prosenttinen agaroosigeeli, joka sisältää DNA-värjäysreagenssia, kuten SYBR safe tai EtBr. Tämän jälkeen ladata yksi kilobase molekyylimassa standardin päälle geeli, ja ajaa elektroforeesi, kunnes edessä väriaine on noin 0,5 senttimetriä pohjasta geeli. Kun geelielektroforeesi on valmis, visualisoi geeli sinisellä vaalealla transilluminaattorilla. Se gDNA pitäisi näkyä paksu bändi, yli 10 kilobase kooltaan ja on vähän tahroja.
tämän Jälkeen luoda serial laimennokset gDNA, label kolme mikrosentrifugiputkille kuin 10X, 100X, ja 1000X., Sitten, käytä pipetin luopua 90 mikrolitraa steriiliä tislattua vettä jokaiseen putket. Lisää seuraavaksi 10x putkeen 10 mikrolitraa gDNA-liuoksesta. Pipetoi koko tilavuus ylös ja alas, jotta liuos sekoittuu huolellisesti. Sitten, Poista 10 mikroliterit liuosta 10x putki ja siirtää tämän 100X putki. Sekoita liuos edellä kuvatulla tavalla. Siirrä lopuksi 10 mikrolitraa liuosta 100x putkeen 1000x putkeen.
PCR-protokollan käynnistämiseksi sulata tarvittavat reagenssit jäihin. Sitten, valmistella PCR master mix., Koska DNA-polymeraasi on aktiivinen huoneenlämmössä, syntyvän reaktion on tapahduttava jäällä. Näyte 49 mikroliteristä sekoitetaan kuhunkin PCR-putkeen. Lisää sitten yksi mikrolitra mallin kunkin koe-putket ja yksi mikrolitra steriiliä vettä negatiivinen kontrolli putken pipetointi ylös ja alas sekoitetaan. Tämän jälkeen aseta PCR-kone taulukossa kuvatun ohjelman mukaan. Aseta putket termosykleriin ja käynnistä ohjelma.,
Kun ohjelma on valmis, tarkastella tuotteen laatua kautta agaroosia geeli elektroforeesi, kuten aiemmin on osoitettu. Onnistuneen reaktion käyttää kuvattu pöytäkirjan pitäisi tuottaa yksi bändi noin 1,5 kilobase. Tässä esimerkissä 100x laimennettua gDNA: ta sisältävä näyte tuotti korkeimman laatutuotteen. Seuraavaksi puhdistaa paras PCR tuote, tässä tapauksessa, 100X gDNA, kaupallisesti saatavilla kit. Nyt PCR-tuote voidaan lähettää sekvensoitavaksi.
tässä esimerkissä PCR-tuote sekvensoidaan eteenpäin ja taaksepäin alkulukuja käyttäen., Näin syntyy kaksi tietokokonaisuutta, joista jokainen sisältää DNA-sekvenssin ja DNA-kromatogrammin: toinen etummaisen primerin ja toinen käänteisen primerin. Tutki ensin kunkin primerin tuottamat kromatogrammit. Ihanteellinen kromatogrammi olisi tasaisesti välitetty huiput vähän tai ei taustasignaaleja.
Jos kromatogrammien näyttö kaksinkertainen huippuja, useita DNA-malleja on saattanut olla läsnä PCR-tuotteet ja järjestys on hävitettävä. Jos kromatogrammien sisälsi huiput eri värejä samassa paikassa, sekvensointi ohjelmistoja todennäköisesti miscalled nukleotidit., Tämä virhe voidaan tunnistaa ja korjata manuaalisesti tekstitiedostossa. Laajojen piikkien esiintyminen kromatogrammissa kertoo resoluutiokatosta, joka aiheuttaa nukleotidien laskuvirheen lähialueilla. Tätä virhettä on vaikea korjata, ja kohtaanto-ongelmia olisi pidettävä epäluotettavina kaikissa myöhemmissä vaiheissa. Huono kromatogrammi lukemisen laatu, merkitty läsnäolo useita huippuja, tapahtuu yleensä viisi prime ja kolme prime päät järjestyksessä. Jotkut sekvensointiohjelmat poistavat nämä heikkolaatuiset osiot automaattisesti., Jos sekvenssiä ei typistetty automaattisesti, tunnista heikkolaatuiset fragmentit ja poista niiden pohjatekstitiedostosta.
käytä DNA-assembly-ohjelmaa kahden primer-sekvenssin kokoamiseen yhdeksi jatkuvaksi sekvenssiksi. Muista, sekvenssit saatu eteenpäin ja käänteinen pohjamaalit pitäisi osittain päällekkäisiä. DNA-assembly-ohjelmassa aseta kaksi sekvenssiä FASTA-muodossa sopivaan ruutuun. Sitten, napsauta Lähetä-painiketta ja odota ohjelman palauttaa tulokset.
nähdäksesi kootun sarjan, klikkaa contigs in the results-välilehdessä., Sitten, tarkastella yksityiskohtia linjaus, valitse kokoonpano yksityiskohtia. Siirry sivustoon, basic local alignment search tool, tai RÄJÄHDYS, ja valitse nukleotidin BLAST työkalu vertailla järjestyksessä tietokantaan. Kirjoita sekvenssi kyselyn järjestyksessä teksti-ruutuun ja valitse sopiva tietokanta selaa valikkoa. Lopuksi, klikkaa BLAST-painiketta alareunassa sivun, ja odota työkalu palauttaa eniten samanlaisia sekvenssejä tietokannasta.
tässä esimerkissä kärkihitti on B., subtilis-kanta 168, osoittaa 100% identiteetin järjestyksessä RÄJÄHDYS tietokantaan. Jos top osuma ei näytä 100% identiteetti odotettu laji tai kanta, klikkaa sekvenssi, joka parhaiten vastaa oman kyselyn tiedot linjaus. Tasoitettuihin nukleotideihin liitetään lyhyet pystyviivat ja niiden välillä on aukkoja. Keskitytään tunnistetut ristiriitaiset alueet, tarkistaa järjestyksessä ja toista BLAST-haku, jos halutaan.