en abril de este año, fuimos testigos de uno de los logros más monumentales de la biología: la secuenciación completa del genoma humano. La decodificación y la deposición de bases de datos de miles de millones de bases de secuencia es el punto de partida de la genómica funcional postsecuencia. El descubrimiento de la Tabla periódica tuvo un impacto importante en la química., Así también, el desciframiento completo del genoma humano tendrá efectos impresionantes en la salud humana y la calidad de vida. Actualmente, entendemos la función de solo un número limitado de genes humanos. Estudiar la función de todos los genes humanos es un desafío tecnológico. Para hacer frente a este desafío, se han desarrollado nuevas herramientas de alto rendimiento. El ensayo de microarray es una potente tecnología molecular que permite el estudio simultáneo de la expresión de miles de genes o sus productos de ARN, dando una imagen precisa de la expresión génica en la célula o la muestra en el momento del estudio.,
por ejemplo, la expresión de todos los genes para la resistencia a los medicamentos y el metabolismo o todos los oncogenes conocidos en una célula se puede detectar y medir en el mismo período de tiempo (Brown y Botstein, 1999; Collins, 1999; Lander, 1999). El microarray se puede definir como una colección ordenada de microspots (las sondas), cada punto contiene una sola especie de un ácido nucleico y representa los genes de interés. Esta tecnología se basa en la hibridación entre blancos libres Etiquetados derivados de una muestra biológica y un conjunto de muchas sondas de ADN que se inmovilizan en una matriz (Southern et al.,, 1999). Las dianas son producidas por transcripción inversa y el etiquetado simultáneo de extractos de ARN de una muestra biológica hibridada con sondas de fragmentos de ADN. La señal de hibridación producida en cada sonda es el nivel de expresión del ARNm del gen correspondiente en la muestra en el momento del estudio. Las señales se detectan, cuantifican, integran y normalizan con software específico y reflejan el «perfil de expresión génica» o el «retrato molecular» de cada muestra biológica.,
Se pueden imprimir muchos miles o decenas de miles de puntos distintos en una diapositiva de silicona o vidrio o en una base de estado sólido de nylon. Existen principalmente dos variantes de microarrays: cDNA y microarrays de oligonucleótidos (Schena et al., 1995, 1996; Lockhart et al., 1996). Aunque ambos tipos de microarrays se utilizan para analizar los patrones de expresión génica, estas variantes son fundamentalmente diferentes (Lipshutz et al., 1999). En los microarrays del cDNA, las moléculas relativamente largas de la DNA se inmovilizan en una superficie sólida. Este tipo de microarray se usa principalmente para estudios de detección y expresión a gran escala., El microarray del oligonucleótido es fabricado por la síntesis química luz-dirigida in situ o por la síntesis convencional seguida por la inmovilización en una matriz de cristal. Este microarray se utiliza para la detección de mutaciones, mapeo de genes y estudios de expresión y permite la detección diferencial de miembros de la familia de genes o transcripciones alternativas que no son distinguibles por los microarrays de ADNc.
la química del microarray en sí misma no es nueva, ya que la tecnología de hibridación ha estado bien establecida durante décadas., Sin embargo, el estudio simultáneo de miles de genes transforma la técnica de microarray en una poderosa herramienta analítica de todo el sistema. Han pasado casi 10 años desde que se crearon los primeros microarrays, y sin embargo esta tecnología sigue mejorando y avanzando. Desde su introducción inicial, el número de aplicaciones de microarray ha aumentado (Figura 1). A partir de su uso en el cribado genético y la identificación de objetivos, esta tecnología está encontrando nuevas aplicaciones, como la biología del desarrollo, la clasificación de enfermedades, los estudios de vías, el descubrimiento de fármacos y la toxicología., La tecnología involucrada en la producción y uso del microarray está más allá del alcance de esta revisión, pero ha sido ampliamente revisada en otros lugares (Schena et al., 1995; Niemeyer y Blohm, 1999; Bowtell, 1999; Brown y Botstein, 1999; Celis et al., 2000; Cheung et al., 1999; Duggan et al., 1999; Graves, 1999; Khan et al., 1999; Hegde et al., 2000; Meldrum, 2000). Describimos aquí algunos de los desarrollos y resultados recientes en la tecnología de microarray en la investigación del cáncer, discutimos problemas potenciales, describimos aplicaciones clínicas y comentamos sobre el futuro de esta tecnología.,
número de citas encontradas en MEDLINE insertando ‘microarray’ (barra gris) o ‘microarray+cancer’ (barra blanca) para una búsqueda en PubMed. Se publicaron artículos entre 1995 y 2002
la importancia de medir la expresión génica global en cánceres humanos
caracterizar la población de genes transcritos ha llevado a la creación de un nuevo término, el transcriptoma (Su et al., 2002)., Este concepto define el conjunto completo de genes transcritos expresados como ARN mensajero para una especie en particular. El transcriptoma, por lo tanto, representa el universo de mensajeros de ARN que pueden codificar proteínas. Solo aproximadamente el 5% de los genes están activos en una célula en particular en un momento dado. La mayoría de los genes son reprimidos, y este control puede ocurrir a nivel transcripcional o traslacional. Dado que la regulación de la expresión proteica a nivel de transcripción es más eficiente, la mayor parte del control se lleva a cabo a este nivel., El perfil de expresión génica de una célula determina su función, fenotipo y respuesta a estímulos externos. Por lo tanto, los perfiles de expresión génica pueden ayudar a elucidar las funciones celulares, las vías bioquímicas y los mecanismos reguladores. Además, los perfiles de expresión génica de las células/tejidos de la enfermedad, en comparación con los controles normales, pueden promover la comprensión de la patología de la enfermedad e identificar nuevos puntos terapéuticos de intervención, mejorando el diagnóstico y aclarando el pronóstico.,
durante los últimos años, varios métodos de perfilado de expresión génica han surgido y se han aplicado con éxito a la investigación del cáncer. Estos incluyen la visualización diferencial, el análisis en serie de la expresión génica y los microarrays(Velculescu et al., 1995; Granjeaud et al., 1999; Cheng et al., 2002). Los microarrays se han vuelto importantes porque son más fáciles de usar, no requieren secuenciación de ADN a gran escala y permiten la cuantificación paralela de miles de genes de múltiples muestras., El perfil de expresión génica de los cánceres representa la categoría más grande de investigación que utiliza la tecnología de microarrays y parece ser el enfoque más integral para caracterizar el cáncer molecularmente. Aunque el fenotipo del cáncer solo está determinado parcialmente por su transcriptoma, todavía proporciona una imagen clara del estado fisiológico de una célula. El poder de este enfoque se ha demostrado en estudios realizados en una amplia variedad de neoplasias malignas, incluidos cánceres de mama, cabeza y cuello, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata y estómago (Bhattacharjee et al.,, 2001; Dhanasekaran et al., 2001; Garber et al., 2001; Tonin et al., 2001; al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen et al., 2002; Han et al., 2002; Hedenfalk et al., 2002; Hippo et al., 2002; Luo et al., 2002a).,en comparación con su correspondiente muestra de control para medir las diferencias y similitudes entre ambos fenotipos, la estratificación del cáncer, en la que se comparan los perfiles de expresión génica de diferentes muestras del mismo tipo de cáncer para revelar subgrupos distintos para definir mejor la clasificación molecular de un tipo histológico común de cáncer, y finalmente la evaluación temporal del tumor, en la que se comparan los patrones de expresión génica de muestras tumorales derivadas de diferentes etapas de progresión para dilucidar las diferencias entre los estadios temprano y avanzado de la enfermedad., Aunque se han publicado muchos estudios de análisis de microarrays en enfermedades humanas, presentamos aquí algunos de los que tienen un interés clínico en oncología.
microarrays y cáncer de próstata
se han publicado recientemente varios estudios que utilizan microarrays para caracterizar perfiles de expresión génica del cáncer de próstata. Estos estudios han utilizado la tecnología de microarray como una herramienta de descubrimiento de genes para identificar marcadores genéticos que discriminan entre los tejidos prostáticos normales y cancerosos., Se ha realizado un estudio simple de microarrays utilizando matrices de membranas manchadas para analizar tejidos normales y cancerosos y líneas celulares (Bull et al., 2001). Los hallazgos de microarrays de membrana están limitados por la relativa insensibilidad de esta técnica para detectar transcripciones expresadas en niveles bajos y el pequeño número de manchas que se pueden colocar en las membranas; sin embargo, este estudio ha arrojado marcadores candidatos de cáncer de próstata para una evaluación posterior., Cinco estudios publicados han analizado perfiles de expresión génica en varios miles de genes en tejidos normales y prostáticos y han utilizado análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado para clasificar especímenes (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh et al., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) fueron capaces de distinguir muestras de próstata normal, hiperplasia prostática benigna (HPB), cáncer de próstata localizado y cáncer de próstata metastásico utilizando 9.984 microarrays con manchas de elementos. Usando análisis de clustering jerárquico, Luo et al., (2001) fueron capaces de discriminar 16 muestras de cáncer de próstata de nueve muestras de HPB sobre la base de las diferencias en los perfiles de expresión génica medidos en 6.500 microarrays de ADNc manchados por elementos. Welsh et al. (2001a) reportaron una clasificación similar de muestras de tejido prostático normal y maligno usando microarrays de oligonucleótidos. Curiosamente, los cinco grupos identificaron que la serina proteasa transmembrana hepsina mostraba una expresión significativamente mayor en los tejidos malignos en comparación con la del tejido prostático normal (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al.,, 2001a; Singh et al., 2002). Muchos otros marcadores candidatos de cáncer de próstata, como el proto-oncogén PIM1, han surgido de otros estudios y se están investigando más a fondo como posibles marcadores diagnósticos. La disminución de la expresión de PIM1 en la inmunohistoquímica de muestras de tumores de próstata confirió un mayor riesgo de recurrencia después de la cirugía (Dhanasekaran et al., 2001). Otros grupos que usan combinaciones de hibridación sustractiva y análisis de microarrays han identificado varios candidatos potenciales para la terapia inmunomoduladora del cáncer de próstata, incluido prostein (Xu et al.,, 2001), STEAP (Hubert et al., 1999) y p504S/Alfa-Metilacil-coa-Racemasa (Jiang et al., 2001). En un estudio muy reciente, Virolle et al. (2003) utilizaron una línea celular de cáncer de próstata que expresa un alto nivel constitutivo de la proteína Egr1, un factor de transcripción sobreexpresado en la mayoría de las células tumorígenas agresivas de cáncer de próstata. Evaluaron la regulación transcripcional de Egr1, realizando un análisis de microarrays de oligonucleótidos utilizando células deficientes en Egr1 como muestra de comparación para la identificación de genes diana de Egr1., Por primera vez en los tejidos de la próstata, este estudio confirmó el papel potenciador del crecimiento de Egr1 observado previamente en otros sistemas celulares, e identificó varios nuevos genes diana que controlan específicamente el crecimiento, la progresión del ciclo celular y las vías apoptóticas.
Microarray y cáncer oral
hasta la fecha, solo se han publicado unos pocos estudios de microarray relevantes para el cáncer oral. Chang et al. (1998) ilustraron el uso de microarrays de cDNA para caracterizar genes relacionados con la transformación en cáncer oral. Villaret et al., se utilizó una combinación de sustracción de ADN complementaria y análisis de microarrays para evaluar genes únicos específicos para el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) como posibles marcadores tumorales y candidatos a vacunas. Se encontró que nueve genes conocidos estaban significativamente sobreexpresados en HNSCC en comparación con el tejido normal. Además, se sobreexpresaron cuatro genes nuevos en un subconjunto de tumores (Villaret et al., 2000). Alevizos et al. (2001) analizaron el transcriptoma en el carcinoma de células escamosas de la cavidad oral., Encontraron cerca de 600 genes candidatos (oncogenes, supresores tumorales, factores de transcripción, marcadores de diferenciación, proteínas metastásicas y enzimas xenobióticas) que se expresaron diferencialmente en el cáncer oral, validando solo tres de estos genes por PCR.
Lu et al. (2001) utilizaron el enfoque de microarray para evaluar los cambios en el perfil de expresión génica durante el inicio y la progresión del carcinoma de células escamosas de esófago., Examinaron los perfiles de expresión génica en diferentes etapas del inicio y la progresión del cáncer de esófago con el fin de identificar genes expresados diferencialmente entre estas etapas. Frierson et al. (2002) utilizaron análisis de microarrays de oligonucleótidos para estudiar la expresión de 8,920 genes humanos diferentes en 15 carcinomas quísticos adenoides (Acc), una línea celular ACC y cinco glándulas salivales principales normales., Entre los genes con expresión alterada en ACC fueron los que codifican los factores de transcripción sox4 y AP-2 gamma, caseína quinasa 1, así como epsilon y frizzled-7, ambos de los cuales son miembros de la vía de señalización Wnt/beta-catenina. En un estudio muy reciente, Leethanakul et al. (2003) generated high-complexity cDNA libraries from laser capture microdisected normal and cancer squamous epitelium. En este estudio, los autores encuestaron la información de secuencia disponible utilizando herramientas bioinformáticas e identificaron 168 genes nuevos expresados diferencialmente en epitelio normal y maligno., Además, utilizando matrices de ADNc, obtuvieron evidencia de que un subconjunto de estos nuevos genes podría ser altamente expresado en HNSCC.
microarray y cáncer de mama
dada la heterogeneidad clínica del cáncer de mama, la tecnología de microarray puede ser un instrumento ideal para establecer una clasificación más precisa. Los estudios iniciales que utilizan perfiles de expresión basados en microarray demostraron su capacidad para clasificar correctamente los cánceres de mama con receptores de estrógeno negativos y con receptores de estrógeno positivos (Perou et al., 2000; West et al.,, 2001) y para diferenciar los tumores relacionados con el BRCA1 de los tumores esporádicos y relacionados con el BRCA2 (Hedenfalk et al., 2001; van’T Veer et al., 2002).
El estudio de van’t Veer et al. ha sido uno de los estudios más extensos e informativos realizados hasta la fecha. Los autores examinaron 117 muestras primarias de mama mediante perfiles de expresión génica basados en microarrays para desarrollar perfiles pronósticos y compararlos con marcadores pronósticos conocidos en cáncer de mama. De los 5.000 genes con perfiles de expresión variable, se identificaron 70 para una precisión óptima en la predicción de la enfermedad recurrente., Usando esta clasificación, los autores predijeron correctamente el resultado real de la enfermedad para 65 de los 78 pacientes. Cinco pacientes con buen pronóstico y ocho pacientes con mal pronóstico fueron asignados incorrectamente. Se utilizaron marcadores pronósticos estándar en el cáncer de mama para estimar el riesgo de recidiva del cáncer y ayudar a tomar decisiones sobre la terapia adyuvante. Desafortunadamente, los marcadores pronósticos actuales no identifican adecuadamente la terapia más correcta para el paciente., El poder predictivo del enfoque de microarrays es mucho mayor que el de los enfoques utilizados actualmente, pero necesita ser validado en estudios clínicos más prospectivos. Si se confirmara el valor pronóstico de este abordaje, el clasificador de perfil de expresión resultaría en una disminución de alrededor de cuatro veces en los pacientes que reciben terapia adyuvante innecesariamente (Caldas y Aparicio, 2002).
Martin et al. (2001) describieron un método para identificar el cáncer de mama circulante mediante un proceso de dos pasos de visualización diferencial y perfiles de expresión basados en matrices de alta sensibilidad., Incluso si el potencial de esta técnica es prometedor, su sensibilidad y especificidad aún deben mejorarse y se requiere más trabajo para determinar la importancia clínica de la detección del perfil de expresión génica en la sangre periférica. Algunos artículos han demostrado un vínculo entre los perfiles de expresión tumoral que utilizan la tecnología de microarray y el resultado clínico. Por ejemplo, Sorlie et al. (2001) demostraron que las subclases tumorales definidas por el perfil de expresión pueden predecir la supervivencia sin enfermedad y la supervivencia general, y Sotiriou et al., (2002) mostraron que los perfiles de expresión pretratamiento predijeron la respuesta clínica a la quimioterapia en una pequeña muestra de tumores de mama. Aunque el estudio de Sorlie et al. fue muy provocador, los autores no compararon el valor pronóstico de los grupos identificados por agrupamiento jerárquico con los factores pronósticos utilizados actualmente en cáncer de mama., Dado que la resistencia a los medicamentos en el cáncer es un obstáculo importante para el éxito de la quimioterapia, la viabilidad de obtener un posible perfil molecular o huella digital de los medicamentos contra el cáncer en las células cancerosas mediante la tecnología de microarray es fundamental para predecir la respuesta a la quimioterapia. Kudoh et al. (2000) demostraron esta capacidad para definir cambios en los perfiles de expresión génica en una línea celular de cáncer de mama tratada con quimioterapia. Supervisaron los perfiles de expresión de las células de cáncer de mama MCF-7 que fueron tratadas transitoriamente con doxorrubicina o seleccionadas por resistencia a la doxorrubicina., Este estudio mostró que el tratamiento transitorio con doxorrubicina alteró la expresión de un grupo diverso de genes de una manera dependiente del tiempo.
microarrays y cáncer de ovario
en los últimos años, varios investigadores han publicado estudios interesantes sobre el perfil de expresión de los cánceres de ovario. Martoglio et al. (2000) analizaron los perfiles de expresión génica de cinco ovarios normales y cuatro muestras de adenocarcinoma seroso papilar de ovario pobremente diferenciadas., Utilizando un pequeño microarray de membrana de nailon «interno», encontraron un aumento global de marcadores relacionados con la angiogénesis (por ejemplo, angiopoyetina-1, VEGF), marcadores apoptóticos y neoplásicos, mediadores de la respuesta inmune y nuevos marcadores potenciales de cáncer de ovario (por ejemplo, cofilina, moesina y proteína del factor silenciador restrictivo de las neuronas) en el tejido canceroso. El estudio fue intrigante porque utilizaron una matriz de ADNc de bajo costo diseñada para estudios de vías específicas, como la angiogénesis y la tumorogénesis., Dado que es problemático acceder a una cantidad adecuada de tejido tumoral de ovario temprano, los investigadores utilizaron diferentes estrategias para eludir la necesidad de cantidades de tejido típicamente requeridas por el análisis de microarray. Por ejemplo, Ismail et al. (2000) informaron de un estudio de 864 elementos de ADN examinados contra 10 líneas de células de cáncer de ovario y cinco líneas de células epiteliales normales utilizando cultivos celulares a corto plazo para expandir el epitelio de la superficie ovárica antes de la extracción de ARN., Otros investigadores purificaron el epitelio ovárico mediante procedimientos in vitro, como la adherencia al vidrio o el enriquecimiento inmunomagnético(on et al., 2000; Welsh et al., 2001b). Sin embargo, estos dos enfoques pueden introducir sesgos en la expresión génica observada. De hecho, el primer enfoque (Ismail et al., 2000) utiliza células cancerosas cultivadas, que pueden no reflejar cánceres in vivo debido a la posibilidad de cambios secundarios en la expresión génica que ocurren in vitro como resultado de condiciones de cultivo. La segunda estrategia (on et al., 2000; Welsh et al.,, 2001b) es muy largo y puede resultar en la degradación de mensajeros de ARN menos estables. Para evitar posibles sesgos inherentes a los cultivos in vitro utilizados en algunos estudios (Ismail et al., 2000; Matei et al., 2002), otros investigadores han estudiado patrones de expresión génica directamente de tumores resecados quirúrgicamente (Shridhar et al., 2001). Los microarrays pequeños y especializados tienen varias ventajas prácticas y pueden revelar información que puede perderse en microarrays más grandes. Sawiris et al., (2002) utilizaron un microarray altamente especializado del cDNA llamado ‘Ovachip’, y encontraron este microarray extremadamente sensible en diferenciar el cáncer ovárico del cáncer de colon basado en patrones de expresión génica. Los biomarcadores de detección del cáncer de ovario son muy importantes debido a la etapa tardía del diagnóstico y la supervivencia precaria asociada con este tipo de cáncer., Recientemente, dos estudios utilizaron tecnología de microarray para identificar dos marcadores séricos potenciales sobreexpresados de cáncer de ovario llamados osteopontina y prostasin, e informaron la validación preliminar de su uso para la detección temprana de la enfermedad (Mok et al., 2001; Kim et al., 2002).
Microarray y otros cánceres
la aplicación de la tecnología de microarray a otros cánceres humanos se está expandiendo rápidamente. El estudio pionero de Golub et al., (1999) demostraron la posibilidad de distinguir la leucemia mieloide aguda y la leucemia linfoblástica aguda (lla) basándose en el monitoreo de la expresión génica y cómo, en una situación simulada «ciega» al diagnóstico histológico, las dos clases podrían haber sido descubiertas solo por los patrones de expresión génica. Alizadeh et al. (2000) identificaron las dos formas de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) sobre la base de perfiles de expresión génica que son indicativos de diferentes estadios de diferenciación de células B., Curiosamente, esta clasificación molecular tiene valor pronóstico independiente de la estratificación por la clasificación clínica habitual. Para estudiar la expresión génica en las neoplasias linfoides, un gran grupo colaborativo creó un microarray especializado, llamado’ Lymphochip’, que se enriquece en genes que se expresan selectivamente en linfocitos y en genes que regulan la función de los linfocitos (Alizadeh et al., 1999). Este grupo utilizó este microarray para examinar el DLBCL y encontró dos formas molecularmente diferentes de este tumor., Además, demostraron que los subgrupos DLBCL definían un subgrupo de pacientes con un pronóstico clínico distinto. Para probar la hipótesis de que la leucemia linfocítica crónica de células B (LLC) es más de una enfermedad, Rosenwald et al. (2001) relacionaron los patrones de expresión génica de la LLC con su estado mutacional de Ig y con otros tipos de células B normales y malignas. Curiosamente, los genes identificados como altamente expresados en LLC en comparación con DLBCL se expresaron de forma equivalente en todas las muestras de LLC, independientemente de su estado mutacional de Ig., Este estudio sugirió que todos los casos de LLC compartían un mecanismo común de transformación y/o célula de origen. Un estudio reciente (Stratowa et al., 2001) ha propuesto una lista de posibles nuevos marcadores pronósticos relacionados con el tráfico de linfocitos y relacionados con la estadificación de la enfermedad y/o la supervivencia del paciente.
en un estudio muy reciente, Gariboldi et al. (2003) analizaron los perfiles de expresión génica en el tejido normal de ratones de piel susceptibles y resistentes a tumores con el fin de identificar genes que desempeñan un papel funcional en la susceptibilidad genética., Este estudio ha sugerido un papel del gen Scca2, un miembro de la superfamilia de inhibidores de la serina proteasa, en la predisposición genética a los tumores de piel.
La tecnología de Microarray también se ha utilizado en el análisis del melanoma (Bittner et al., 2000). Este estudio indicó que los perfiles de expresión génica dentro del tejido de un paciente individual pueden conservarse notablemente con el tiempo y que el análisis de transcripción global puede identificar subtipos no reconocidos de melanoma cutáneo y predecir características fenotípicas verificables experimentalmente.,
Los estudios sobre células y tejidos de cáncer de colon demostraron una supresión significativa del gen de la quinasa, WEE1Hu (Backert et al., 1999).
muchos transcriptomas cambian después de una sobreexpresión específica de genes relacionados con el tumor. Por ejemplo, hemos utilizado un sistema de expresión mediado por adenovirus del gen supresor tumoral RB2/p130 en una línea celular de cáncer de pulmón no pequeño para identificar genes específicos que están regulados por pRb2/p130 (Russo et al., 2003)., Nuestros resultados de microarray han identificado una variedad de genes implicados en muchos procesos celulares incluyendo división celular, señalización celular / comunicación celular, estructura celular/motilidad y expresión génica y metabolismo. Estos resultados sugieren nuevos biomarcadores terapéuticos potenciales en el carcinoma de pulmón. Además, los resultados de otro estudio de microarray de cDNA indican que la sobreexpresión del gen supresor tumoral PTEN puede inhibir la invasión del cáncer de pulmón al regular a la baja un panel de genes (Hong et al., 2000)., A la luz de los datos anteriores, está claro que el enfoque de microarray es muy importante en el análisis de una variedad de tipos de tumores.