La Tierra es el hogar de millones de especies bacterianas, cada una con características únicas. La identificación de estas especies es fundamental en la evaluación de muestras ambientales. Los médicos también necesitan distinguir diferentes especies bacterianas para diagnosticar a los pacientes infectados.
para identificar bacterias, se pueden emplear una variedad de técnicas, incluida la observación microscópica de la morfología o el crecimiento en un medio específico para observar la morfología de la colonia., El análisis genético, otra técnica para identificar bacterias ha crecido en popularidad en los últimos años, debido en parte a la secuenciación del gen ARN ribosomal 16S.
el ribosoma bacteriano es un complejo de ARN de proteína que consta de dos subunidades. La subunidad 30S, la más pequeña de estas dos subunidades, contiene 16S rRNA, que está codificada por el gen 16S rRNA contenido dentro del ADN genómico. Regiones específicas de 16S rRNA están altamente conservadas, debido a su función esencial en el ensamblaje de ribosomas. Mientras que otras regiones, menos críticas para funcionar, pueden variar entre las especies bacterianas., Las regiones variables en 16S rRNA, pueden servir como huellas moleculares únicas para las especies bacterianas, lo que nos permite distinguir cepas fenotípicamente idénticas.
después de obtener una muestra de calidad de gDNA, puede comenzar la PCR del gen codificador 16S rRNA. La PCR es un método de biología molecular comúnmente utilizado, que consiste en ciclos de desnaturalización de la plantilla de ADN de doble cadena, recocido de pares de cebadores universales, que amplifican regiones altamente conservadas del gen, y la extensión de cebadores por la ADN polimerasa., Mientras que algunos cebadores amplifican la mayor parte del gen codificador del ARNr 16S, otros solo amplifican fragmentos del mismo. Después de la PCR, los productos se pueden analizar mediante electroforesis en gel de agarosa. Si la amplificación fue exitosa, el gel debe contener una sola banda del tamaño esperado, dependiendo del par de imprimación utilizado, hasta 1500bp, la longitud aproximada del gen 16S rRNA.
Después de la purificación y secuenciación, las secuencias obtenidas se pueden ingresar en la base de datos de BLAST, donde se pueden comparar con las secuencias de referencia 16S rRNA., Como esta base de datos devuelve coincidencias basadas en la mayor similitud, esto permite confirmar la identidad de la bacteria de interés. En este video, observará la secuenciación del gen 16S rRNA, incluyendo PCR, análisis y edición de secuencias de ADN, ensamblaje de secuencias y búsqueda de bases de datos.
al manipular microorganismos, es esencial seguir buenas prácticas microbiológicas, incluyendo el uso de técnicas asépticas y el uso de equipos de protección personal adecuados. Después de realizar una evaluación de riesgo adecuada para el microorganismo o muestra ambiental de interés, Obtener un cultivo de prueba., En este ejemplo, se utiliza un cultivo puro de Bacillus subtilis.
Para comenzar, cultivar su microorganismo en un medio adecuado en las condiciones adecuadas. En este ejemplo, Bacillus subtilis 168 se cultiva en caldo LB durante la noche en una incubadora agitadora a 200 rpm a 37 grados Celsius. A continuación, utilice un kit disponible comercialmente para aislar el ADN genómico o gDNA de 1,5 mililitros del cultivo nocturno de B. subtilis.
para verificar la calidad del ADN aislado, primero mezcle cinco microlitros del ADN aislado con un microlitro de tinte de carga de gel de ADN. Luego, cargue la muestra en un 0.,Gel de agarosa al 8%, que contiene reactivo de tinción de ADN, como SYBR safe o EtBr. Después de esto, cargue un estándar de masa molecular de una kilobase en el gel y ejecute la electroforesis hasta que el tinte frontal esté aproximadamente a 0.5 centímetros de la parte inferior del gel. Una vez completada la electroforesis en gel, visualice el gel en un transiluminador de luz azul. El gDNA debe aparecer como una banda gruesa, por encima de 10 kilobase en tamaño y tener un frotis mínimo.
después de esto, para crear diluciones en serie de la gDNA, etiqueta tres tubos de microcentrífuga como 10X, 100X y 1000x., Luego, use una pipeta para dispensar 90 microlitros de agua destilada estéril en cada uno de los tubos. A continuación, agregue 10 microlitros de la solución gDNA al tubo 10X. Pipetee todo el volumen hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la solución se mezcla bien. Luego, retire 10 microlitros de la solución del tubo de 10x y transfiera esto al tubo de 100x. Mezcle la solución como se describió anteriormente. Finalmente, transfiera 10 microlitros de la solución en el tubo de 100x, al tubo de 1000x.
Para comenzar el protocolo de PCR, descongelar los reactivos necesarios en hielo. A continuación, preparar la PCR master mix., Dado que la ADN polimerasa está activa a temperatura ambiente, la reacción establecida debe ocurrir en el hielo. Alícuota 49 microlitros de la mezcla maestra en cada uno de los tubos de PCR. Luego, agregue un microlitro de plantilla a cada uno de los tubos experimentales y un microlitro de agua estéril al tubo de control negativo, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Después de esto, configure la máquina de PCR de acuerdo con el programa descrito en la tabla. Coloque los tubos en el termociclador e inicie el programa.,
Una vez completado el programa, examine la calidad de su producto a través de electroforesis en gel de agarosa, como se demostró anteriormente. Una reacción exitosa utilizando el protocolo descrito debe producir una sola banda de aproximadamente 1,5 kilobase. En este ejemplo, la muestra que contenía 100x gDNA diluido produjo el producto de mayor calidad. A continuación, purificar el mejor producto de PCR, en este caso, el 100x gDNA, con un kit disponible comercialmente. Ahora el producto de PCR se puede enviar para secuenciar.
en este ejemplo, el producto de PCR es secuenciado usando cebadores hacia adelante y hacia atrás., Por lo tanto, se generan dos conjuntos de datos, cada uno con una secuencia de ADN y un cromatograma de ADN: uno para el primer delantero y el otro para el primer inverso. Primero, examine los cromatogramas generados a partir de cada imprimación. Un cromatograma ideal debe tener picos espaciados uniformemente con poca o ninguna señal de fondo.
si los cromatogramas muestran picos dobles, múltiples plantillas de ADN pueden haber estado presentes en los productos de PCR y la secuencia debe descartarse. Si los cromatogramas contenían picos de diferentes colores en la misma ubicación, el software de secuenciación probablemente mal llamado nucleótidos., Este error se puede identificar y corregir manualmente en el archivo de texto. La presencia de picos amplios en el cromatograma indica una pérdida de resolución, lo que causa un mal recuento de los nucleótidos en las regiones asociadas. Este error es difícil de corregir y los desajustes en cualquiera de los pasos posteriores deben tratarse como poco fiables. La mala calidad de lectura del cromatograma, indicada por la presencia de múltiples picos, generalmente ocurre en los cinco extremos primos y tres primos de la secuencia. Algunos programas de secuenciación eliminan estas secciones de baja calidad automáticamente., Si su secuencia no se truncó automáticamente, identifique los fragmentos de baja calidad y elimine sus respectivas bases del archivo de texto.
Use un programa de ensamblaje de ADN para ensamblar las dos secuencias de imprimación en una secuencia continua. Recuerde, las secuencias obtenidas usando cebadores hacia adelante y hacia atrás deben superponerse parcialmente. En el programa de ensamblaje de ADN, inserte las dos secuencias en formato FASTA en la caja apropiada. Luego, haga clic en el botón Enviar y espere a que el programa devuelva los resultados.
para ver la secuencia ensamblada, haga clic en Contigs en la pestaña Resultados., A continuación, para ver los detalles de la alineación, seleccione Detalles de ensamblaje. Vaya al sitio web de la herramienta básica de búsqueda de alineación local, o BLAST, y seleccione la herramienta nucleotide BLAST para comparar su secuencia con la base de datos. Introduzca su secuencia en el cuadro de texto secuencia de consulta y seleccione la base de datos adecuada en el menú desplegable. Finalmente, haga clic en el botón BLAST en la parte inferior de la página y espere a que la herramienta devuelva las secuencias más similares de la base de datos.
en este ejemplo, el golpe más alto es B., subtilis cepa 168, mostrando 100% de identidad con la secuencia en la base de datos de explosiones. Si el golpe superior no muestra 100% identidad a su especie o cepa esperada, haga clic en la secuencia que más se acerque a su consulta para ver los detalles de la alineación. Los nucleótidos alineados se unirán por líneas verticales cortas y los nucleótidos no coincidentes tendrán espacios entre ellos. Centrándose en las regiones no coincidentes identificadas, revise la secuencia y repita la búsqueda de explosión si lo desea.