cómo interfieren las memorias depende de cuándo se produce un nuevo aprendizaje
para probar la hipótesis de que el tiempo del segundo entrenamiento es un factor clave para determinar si se produce una interferencia proactiva o retroactiva, empleamos un paradigma que fue diseñado para investigar la competencia entre dos señales diferentes que se entrenan aparte, pero tienen un resultado común, e.,g., el mismo tipo de respuesta condicionada23. En concreto, se realizó un doble acondicionamiento clásico apetitivo con dos estímulos químicos neutros, gamma-nonalactona o acetato de amilo (los estímulos condicionados), los cuales fueron emparejados con un estímulo alimenticio sobresaliente (sacarosa, el estímulo no condicionado) que activa el circuito de alimentación bien identificado de Lymnaea11,24,25., Un solo emparejamiento de cualquiera de los estímulos condicionados con el estímulo incondicionado conduce a la formación de memoria apetitiva a largo plazo, notablemente, con períodos de no lapso y lapso observados en los mismos puntos de tiempo durante la consolidación de la memoria8,19 (suplemento Fig. 1). El entrenamiento consecutivo con estos dos paradigmas apetitivos se empleó para establecer el tipo de interferencia que ocurre durante un período de no lapso versus un período de lapso de la misma secuencia de consolidación.,
se entrenó a los animales con gamma-nonalactona + sacarosa ( denominado «primer entrenamiento apetitivo»), y luego se aplicó un segundo entrenamiento de acetato de amilo + sacarosa (denominado «segundo entrenamiento apetitivo») en un punto de no lapso (1 h) o lapso (2 h) de la primera memoria. Luego se probó la presencia de memoria a largo plazo 24 h después del primer entrenamiento (Fig. 1a)., Los animales que recibieron el segundo entrenamiento apetitivo en el punto non-lapse retuvieron una memoria para el primer estímulo condicionado (gamma-nonalactona) pero no para el segundo estímulo condicionado (acetato de amilo) (Fig. 1b, ‘no-lapso’), indicativo de interferencia proactiva, mientras que los animales que recibieron el segundo entrenamiento apetitivo durante el punto de lapso tenían una memoria para el segundo estímulo condicionado, pero no para el primer estímulo condicionado (Fig. 1b, «lapso»), indicativo de interferencia retroactiva (animales sometidos a ensayo con gamma-nonalactona: ANOVA unidireccional, p < 0.,001 (F(3,132) = 17.27), Bonferroni test: 1 h vs naïve p < 0.001, first training alone vs naïve p < 0.001, 2 h vs naïve p > 0.05. Amyl acetate tested animals: One-way ANOVA, p < 0.001 (F(3,123) = 9.72), Bonferroni test: 2 h vs naïve p < 0.001, second training alone vs naïve p < 0.001, 1 h vs naïve p > 0.05).
interferencia proactiva y retroactiva y consolidación paralela de memorias asociativas después del acondicionamiento de un solo ensayo. una línea de tiempo simplificada de doble paradigma de condicionamiento apetitivo. B los animales mostraron una mayor respuesta al primer estímulo condicionado (CS), gamma-nonalactone (GNL), después del primer entrenamiento solo (n = 40) o cuando el segundo entrenamiento ocurrió durante el non-lapse (1 h: n = 32) pero no el lapse (2 h: n = 29) en comparación con los controles naïve (n = 35)., Las respuestas al segundo estímulo condicionado, acetato de amilo (AA), fueron mayores en los animales que recibieron un segundo entrenamiento solo (n = 24) o un segundo entrenamiento durante el lapso (2 h: N = 31), pero no en el no lapso (1 h: n = 32) en comparación con los controles naïve (n = 40). Las gráficas de violín muestran la densidad de datos que se extiende de los valores mínimos a los máximos. Las gráficas de caja internas muestran la mediana y el rango intercuartílico (primer y tercer cuartil). Los bigotes representan valores mínimos a máximos. Los círculos muestran la media. C Línea de tiempo simplificada de apetitivo seguido de entrenamiento aversivo., D los animales mostraron una mayor respuesta al estímulo condicionado apetitivo (gamma-nonalactone) después del entrenamiento apetitivo solo (n = 30) o cuando el entrenamiento aversivo ocurrió durante el non-lapse (1 h: n = 29) pero no el lapse (2 h: n = 30) en comparación con los controles naïve (n = 28). Las respuestas al estímulo condicionado aversivo, L-serina (L-s), fueron más bajas en los animales que recibieron entrenamiento aversivo durante el lapso (2 h: n = 29), sin lapso (n = 30) y solo después del entrenamiento aversivo (n = 30) en comparación con los controles naïve (n = 29). E Línea de tiempo simplificada de aversiva seguida de entrenamiento apetitivo., F Los animales mostraron una menor respuesta al estímulo condicionado aversivo después del entrenamiento aversivo solo (n = 20) o cuando el entrenamiento apetitivo ocurrió durante el non-lapse (1 h: n = 20) pero no el lapse (2 h: n = 20) en comparación con los controles naïve (n = 20)., Las respuestas al estímulo condicionado apetitivo fueron mayores en animales que recibieron entrenamiento apetitivo durante el lapso (2 h: n = 20), No lapso (n = 16) y después del entrenamiento apetitivo solo (n = 20) en comparación con controles naïve (n = 20)
fue posible que la ausencia de memoria después de la interferencia se debió a la incapacidad del animal de guarda dos recuerdos similares a largo plazo., Para examinar esto, entrenamos animales con ambos tipos de paradigmas apetitivos pero separados 24 h, permitiendo que la primera memoria se consolide completamente antes del segundo entrenamiento (Fig. 2a). Cada animal fue probado por su respuesta a ambos estímulos condicionados 24 h después del segundo entrenamiento. Para asegurarse de que el orden de las pruebas no afectaba a la respuesta del animal, se analizó primero a un grupo su respuesta a la gamma-nonalactona y luego al acetato de amilo 1 h más tarde, mientras que un segundo grupo las recibió en orden inverso., Ambos grupos mostraron una mayor respuesta a ambos estímulos condicionados en comparación con los animales naïve indicando la presencia de dos recuerdos en el mismo animal (suplemento Fig. 2b).
una hipótesis alternativa es que la incapacidad de consolidar ambas memorias simultáneamente se debe a la competencia entre dos memorias similares que utilizan el mismo circuito neural subyacente. Investigamos si las mismas reglas de interferencia se aplicaron cuando el segundo entrenamiento empleó un paradigma que utiliza un circuito diferente del activado por el primer aprendizaje., El condicionamiento aversivo de la alimentación en Lymnaea es procesado por un circuito neuronal no involucrado en el condicionamiento de la comida-recompensa 26; por lo tanto, se utilizó un paradigma aversivo para probar la hipótesis de la competencia. Un solo emparejamiento de L-serina (un estímulo apetitivo, ver Fig. 1d) con quinina (un estímulo aversivo que inhibe la alimentación27) indujo memoria a largo plazo, expresada como una respuesta de alimentación disminuida al estímulo condicionado, cuando se probó a las 24 h en comparación con controles naïve (naïve feeding difference score: 21.1 ± 2.5, n = 16, L-serina + quinina feeding difference score: 9.8 ± 2.,1, N = 17, test t no Pareado, p = 0,0016, t = 3,47, df = 31). Notablemente, durante la consolidación de la memoria aversiva, los lapsos ocurrieron en los mismos momentos que durante la formación de la memoria apetitiva, demostrando que los lapsos son una característica general durante la consolidación en Lymnaea (suplemento Fig. 3). A continuación, se entrenó a los animales con gamma-nonalactona + sacarosa (entrenamiento apetitivo), seguido de entrenamiento aversivo en los mismos puntos no lapsos o lapsos de la primera memoria que en el paradigma Dual appetitive (Fig. 1c)., El entrenamiento aversivo durante el punto non-lapse dio lugar a una memoria tanto apetitiva como aversiva (Fig. 1d, ‘non-lapse’), indicando la ausencia de interferencia proactiva, mientras que el condicionamiento aversivo durante el lapso de memoria apetitiva resultó en una memoria aversiva, pero no una memoria apetitiva (Fig. 1D, ‘lapse’) (gamma-nonalactone tested animals: One-way ANOVA, p < 0.001 (F(3,113) = 9.47), prueba de Bonferroni: 1 H vs naïve p < 0.001, appetitive alone vs naïve p < 0,001, 2 H vs naïve p > 0,05., Animales probados con L-serina: ANOVA unidireccional, p < 0.001 (F(3,114) = 12.13), prueba de Bonferroni: aversivo solo vs naïve p < 0.001, 1 H vs naïve p < 0,001, 2 h vs naïve p < 0,01).
para comprobar si la falta de interferencia proactiva entre la memoria apetitiva y la aversiva se debía a que esta última era más fuerte que la primera y, por lo tanto, menos propensa a la interferencia, invertimos el orden de entrenamiento, realizando El entrenamiento aversivo seguido del entrenamiento apetitivo (Fig. 1e)., Con este paradigma invertido, observamos el mismo patrón de interferencia de memoria que cuando el entrenamiento apetitivo precedió al entrenamiento aversivo (animales probados con L-serina: ANOVA unidireccional, p < 0.001 (F(3,76) = 7.34), prueba de Bonferroni: 1 H vs naïve p < 0.001, aversivo solo vs naïve p < 0.01, 2 H vs naïve p > 0.05. Animales probados con Gamma-nonalactona: ANOVA unidireccional, p < 0.001 (F(3,72) = 10.18), prueba de Bonferroni: solo apetitivo vs naïve p < 0.,001, 1 H vs naïve p < 0,01, 2 H vs naïve p < 0,001) (Fig. 1f). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la inducción de una nueva memoria asociativa durante el lapso de la primera memoria causa interferencia retroactiva independientemente de si el segundo paradigma de entrenamiento es apetitivo o aversivo. Sin embargo, durante el período de non-lapse, la interferencia proactiva solo ocurre cuando el segundo paradigma de entrenamiento es similar al primero. Con un paradigma diferente, se produce la consolidación de la memoria dual., A continuación, buscamos identificar posibles mecanismos neuronales subyacentes a estas diferencias en la expresión conductual de uno u otro tipo de memoria dependiendo de los paradigmas utilizados.
cómo interfieren dos memorias depende de los circuitos que utilizan
planteamos la hipótesis de que la incapacidad de consolidar simultáneamente dos memorias apetitivas se debe a que ambas están codificadas dentro del mismo circuito de memoria, mientras que el uso de la Asociación aversiva de un mecanismo de circuito distinto permite la consolidación dual fuera de los períodos de lapso., Un cambio celular previamente identificado involucrado en la memoria a largo plazo después del acondicionamiento apetitivo en Lymnaea es la despolarización persistente de una neurona moduladora en la red de alimentación, las CGCs (células gigantes cerebrales)9,28,29. Las puertas de despolarización inducidas por el aprendizaje-en la entrada de estímulo condicionado a la orden de alimentación-como interneuronas, que en animales entrenados resulta en la activación de la red de alimentación9. Aquí, demostramos que ambos tipos de entrenamiento apetitivo inducen la misma despolarización persistente en comparación con los controles naïve (ANOVA unidireccional, p < 0.,001 (F(2,35) = 26.3), prueba de Bonferroni: primer entrenamiento solo vs naïve p < 0.001, segundo entrenamiento solo vs naïve p < 0.001, primer entrenamiento solo vs segundo entrenamiento solo p > 0,05) (Fig. 2a–c). A continuación, comprobamos si el condicionamiento aversivo afectaba a los CCG y no encontramos ningún cambio significativo en su potencial de membrana en comparación con los controles naïve (prueba t no pareada, p = 0,53, t = 0,63, df = 22) (Fig. 2d-f)., No hubo cambio en la resistencia de la membrana del CGC ni en las características de espiga después del acondicionamiento apetitivo o aversivo (resistencia de la membrana del CGC: entrenamiento apetitivo, ANOVA unidireccional, p = 0.17(F (2,34) = 1.77). Entrenamiento aversivo, test t no Pareado, p = 0,67, t = 0,44, df = 22.) (Higo. 2C, f; suplemento Fig. 4a, b). Por lo tanto, ambos paradigmas apetitivos inducen el mismo cambio celular, mientras que el entrenamiento aversivo no afecta las propiedades de esta neurona sugiriendo que la memoria está codificada en otro circuito.
Diferentes sustratos neuronales para apetitivo versus aprendizaje aversivo. trazas representativas de la actividad del CGC 24 h después de que los animales recibieron el primer o segundo entrenamiento apetitivo solos y de animales naïve. b Los ccg de ambos grupos de entrenamiento apetitivo primero (n = 12) y segundo (n = 13) fueron despolarización en comparación con los controles naïve (n = 13), pero no se compararon entre sí. Las gráficas de violín muestran la densidad de datos que se extiende de los valores mínimos a los máximos. Las gráficas de caja internas muestran la mediana y el rango intercuartílico (primer y tercer cuartil)., Los bigotes representan valores mínimos a máximos. Los círculos muestran la media. c la resistencia de la membrana CGC no fue diferente entre Condiciones. D trazas representativas de la actividad de CGC de animales condicionados aversivamente y naïve. e no hubo diferencia significativa en el potencial de membrana entre las dos condiciones (n = 12 para ambas). F La resistencia de la membrana no fue significativamente diferente entre Condiciones. g parcelas de calor de actividad normalizada de PlB en respuesta al estímulo condicionado aversivo (CS) en preparaciones de animales entrenados aversivamente e ingenuos., Datos organizados de actividad de PlB alta a baja después del estímulo condicionado. La línea blanca representa el inicio del estímulo condicionado. h trazas representativas y Gráfico Lineal normalizado de la frecuencia de espiga de PlB en respuesta al estímulo condicionado aversivo. La línea y el sombreado muestran la media ± error estándar de la media, respectivamente. he calentado parcelas de actividad normalizada de PlB en respuesta a estímulos condicionados apetitivos en preparaciones de animales entrenados apetitivos e ingenuos. J trazas representativas y Gráfico Lineal normalizado de la frecuencia de espiga de PlB en respuesta al estímulo condicionado apetitivo., Abreviaturas: appet, apetitivo; avers, aversión; tr, formación; MP, el potencial de membrana; norma, normalizados, preparación, preparación
a continuación trató de identificar los cambios inducidos por la aversión acondicionado. Dado que la respuesta condicionada fue una reducción en la alimentación, razonamos que podría deberse a un efecto inhibitorio aumentado que se origina en el circuito defensivo-retirada., Una neurona candidata para esto es la interneurona Plb30 que conecta los circuitos de retirada y Alimentación y su activación por estímulos aversivos es suficiente para inhibir la alimentación31. En preparaciones encefálicas aisladas de animales condicionados aversivamente, un análogo in vitro del estímulo condicionado (ver Métodos) causó un aumento significativo en la tasa de disparo de PlB en comparación con los controles naïve (prueba de Mann Whitney, P = 0.029, U = 106) (Fig. 2g, h), así como una menor expresión de los ciclos de alimentación ficticios (un correlato in vitro de la respuesta condicionada) (suplemento Fig. 4c, d)., Las tasas de disparo de PlB antes del estímulo condicionado no fueron significativamente diferentes entre Condiciones (prueba t no apareada, p = 0.94, t = 0.08, df = 36). Las respuestas del CGC al estímulo condicionado no mostraron ningún cambio después del condicionamiento aversivo (suplemento Fig. 4e). Se comprobó si la actividad de la PlB estaba alterada después del condicionamiento apetitivo, pero no se encontraron cambios en las tasas de disparo de la PlB en respuesta al estímulo condicionado apetitivo (prueba de Mann Whitney, p = 0.39, U = 56.5) o en sus tasas de disparo antes del estímulo condicionado (prueba t no apareada, P = 0.38, t = 0.89, df = 22) (Fig. 2i, j)., Sin embargo, las preparaciones derivadas de animales apetitivamente condicionados todavía mostraron una mayor respuesta de alimentación ficticia a la gamma-nonalactona en comparación con los controles naïve (suplemento Fig. 4f, g). Estos resultados demuestran que el aprendizaje aversivo causa un aumento en una vía inhibitoria, distinta de los cambios neuronales que sustentan los recuerdos apetitivos. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la competencia dentro del mismo circuito de memoria es un factor limitante en la capacidad de los animales para consolidar múltiples recuerdos similares., Tal competencia no afecta la consolidación de memorias disímiles que dependen de diferentes mecanismos de circuito, lo que explica la falta de interferencia proactiva de las memorias apetitivas y aversivas en el punto de no lapso.
la interferencia retroactiva requiere un nuevo aprendizaje en general
a continuación buscamos diseccionar qué aspecto del segundo entrenamiento fue responsable de la interferencia retroactiva en los puntos de lapso., Probamos si la inducción de una segunda memoria asociativa era necesaria para bloquear la primera memoria o si simplemente la presentación de los estímulos condicionados e incondicionados durante el segundo entrenamiento era suficiente para actuar como un disruptor de la memoria. Para probar esto, realizamos la presentación hacia atrás del estímulo incondicionado + estímulo condicionado (referido como BW) (Fig. 3a), que no dio como resultado la memoria a largo plazo utilizando los protocolos appetitive (prueba de Mann Whitney, p = 0.07, U = 172.5) o aversive (prueba de Mann Whitney, P = 0.67, U = 174.5) (Fig., 3b, c), confirmando que los paradigmas BW no inducen memoria asociativa. A continuación, realizamos acondicionamiento BW apetitivo o aversivo en un punto de lapso de la primera memoria y encontramos que ninguno tuvo un efecto en la expresión de la primera memoria (BW appetitive: prueba de Kruskal–Wallis, p = 0.0043, H = 10.88; prueba de Dunn, BW a 2 H vs naïve p < 0.05 y primer entrenamiento solo vs naïve p < 0.01. BW aversivo: prueba de Kruskal-Wallis, p = 0.001 , H = 13.81; prueba de Dunn, BW a 2 H vs naïve p < 0.,05, primer entrenamiento solo vs naïve p < 0.001) (Fig. 3d-g). Estos resultados sugieren que la inducción de una segunda memoria asociativa es necesaria para la interferencia retroactiva con la primera memoria.
La nueva adquisición de la memoria es necesaria para la interferencia retroactiva. a Time-line of backward conditioning (BW) paradigm., b PC la presentación de sacarosa y acetato de amilo (AA) no provoca una respuesta significativamente mayor al estímulo condicionado (CS) en comparación con los controles naïve cuando se prueban a las 24 h (PC: n = 24, naïve: n = 21). Las gráficas de violín muestran la densidad de datos que se extiende de los valores mínimos a los máximos. Las gráficas de caja internas muestran la mediana y el rango intercuartílico (primer y tercer cuartil). Los bigotes representan valores mínimos a máximos. Los círculos muestran la media. C BW presentación de quinina y L-serina (L-s) no induce una memoria aversiva (BW: n = 19, naïve: n = 20)., d línea de tiempo del PC con sacarosa y acetato de amilo durante el lapso de la primera memoria apetitiva (gamma-nonalactona (GNL) emparejada con sacarosa). e BW durante el lapso no afectó a la memoria a largo plazo en comparación con los controles naïve (2 h: n = 22, primer entrenamiento solo: n = 21, naïve: n = 24). F línea de tiempo de PC con quinina y L-serina durante el lapso de la primera memoria apetitiva (gamma-nonalactona emparejada con sacarosa)., g BW durante el lapso no afectó la memoria a largo plazo en comparación con los controles naïve (2 h: n = 20, solo el primer entrenamiento: n = 20, naïve: n = 20)
esto planteó la cuestión de si es específicamente el nuevo aprendizaje asociativo o el nuevo aprendizaje en general lo que puede causar interferencia retroactiva. Para abordar esto, utilizamos un paradigma no asociativo como segundo entrenamiento. Demostramos que una fuerte estimulación táctil de la cabeza conduce a una respuesta de abstinencia sensibilizada a un breve estímulo de «luz apagada» (Fig. 4a)., Este breve estímulo no desencadenó una respuesta de abstinencia en animales naïve (ANOVA de medidas repetidas, p = 0.62 (F(3,42) = 16.58)) (Fig. 4a). Por el contrario, los animales que fueron expuestos a estimulación táctil fuerte 10 min antes del estímulo ‘light off’ mostraron una respuesta de abstinencia significativa (ANOVA de medidas repetidas, p < 0.001 (F(3,42) = 0.54), prueba de Dunnett: antes vs 5 s p < 0.001, antes vs 10 s p < 0.001, antes de VS 20 s p > 0.05) (fig. 4a)., Así, una fuerte estimulación táctil de la cabeza provoca la sensibilización, una forma de aprendizaje no asociativo.
Nuevo aprendizaje no asociativo es suficiente para la interferencia retroactiva. una estimulación táctil de la cabeza induce una sensibilización a corto plazo. 10 min después de la estimulación táctil, se presentó un breve estímulo de apagado al animal (imagen insertada) y se midió su respuesta de retirada., Los animales mostraron un aumento significativo en la respuesta de retirada al estímulo de luz apagada, que duró 10 s después del estímulo (imagen izquierda, antes del estímulo; imagen derecha, después del estímulo) (n = 15). Los animales Naïve no mostraron una respuesta de retirada significativa al mismo estímulo (n = 15). Los datos muestran Media ± error estándar de la media. b línea de tiempo de aplicación de la estimulación sensibilizante después del acondicionamiento apetitivo., C la sensibilización durante el lapso, pero no durante el no lapso, interrumpe significativamente la memoria del animal para el estímulo condicionado (CS), gamma-nonalactone (GNL), cuando se prueba a las 24 h (solo el primer entrenamiento: n = 29, 2 h: n = 19, 1 h: n = 22, naïve: n = 29). Las gráficas de violín muestran la densidad de datos que se extiende de los valores mínimos a los máximos. Las gráficas de caja internas muestran la mediana y el rango intercuartílico (primer y tercer cuartil). Los bigotes representan valores mínimos a máximos., Los círculos muestran la media
a continuación, aplicamos la estimulación sensibilizante en el punto de lapso de la memoria apetitiva (Fig. 4b). Demostramos que interfería retroactivamente con la memoria asociativa, mientras que cuando se aplicaba en el punto non-lapse, la memoria estaba intacta (ANOVA unidireccional, p < 0.001 (F(3,78) = 7.191), prueba de Bonferroni: primer entrenamiento solo vs naïve p < 0.001, 1 H vs naïve p < 0.01, 2 H vs naïve p > 0.05) (fig. 4c)., Por lo tanto, la adquisición de una memoria asociativa o no asociativa durante el período de lapso interfiere retroactivamente con la memoria asociativa original.
la interferencia retroactiva interrumpe la consolidación de la memoria
a continuación probamos si el reemplazo aparente de la primera memoria por la segunda se debió a la interferencia retroactiva que interrumpió la consolidación de la memoria original o a la supresión de su expresión por la segunda memoria. Si el primer recuerdo no pudiera ser recuperado bloqueando el segundo, esto indicaría que su consolidación fue interrumpida., Sin embargo, si se pudiera recuperar, esto indicaría que la expresión de la primera traza de memoria es suprimida activamente por la segunda memoria coexistente. Para probar esto, se realizó el segundo entrenamiento apetitivo 2 h después del primer entrenamiento apetitivo para interferir con la primera memoria. La estimulación sensibilizante se aplicó 2 h más tarde, en un lapso en la consolidación del segundo aprendizaje (Fig. 5a)para bloquear la segunda memoria (Fig. 5b)., Esto aseguró que la estimulación sensibilizante ocurriera en un punto de lapso de la segunda memoria (2 h) pero en un punto de no lapso de la primera Memoria (4 h) (suplemento Fig. 5A, B muestra que la estimulación sensibilizante es suficiente para bloquear la segunda memoria apetitiva). La aplicación de la estimulación sensibilizante sola 4 h después del primer entrenamiento apetitivo no tiene efecto sobre la primera memoria (suplemento Fig. 5c, d). Aunque este paradigma tuvo éxito en Bloquear la segunda memoria, la expresión de la primera memoria no se restauró a las 24 h (Fig. 5B, gamma-nonalactona)., Por el contrario, cuando no se aplicó estimulación sensibilizante, hubo la interrupción esperada de la primera memoria y la adquisición de la segunda (animales de acetato de amilo probados: ANOVA unidireccional, p < 0.001 (F(2,73) = 21.11), prueba de Bonferroni: sin sensibilización vs naïve p < 0.001, sin sensibilización vs sensibilización p < 0,001, sensibilización vs naïve p > 0,05. Animales analizados con Gamma-nonalactona: ANOVA unidireccional, p = 0,33(F (2,64) = 1,12)) (Fig. 5b).
el Bloqueo de la segunda memoria no conduce a la recuperación de la primera memoria. una línea de tiempo de experimento. Los animales recibieron el primer entrenamiento seguido por el segundo entrenamiento durante el lapso de 2 h. La estimulación sensibilizante se aplicó 2 h después del segundo entrenamiento (4 h después del primer entrenamiento). A continuación, se probó la respuesta de los animales a estímulos condicionados (CS), gamma-nonalactona (GNL) o acetato de amilo (AA) a las 24 h., b La sensibilización fue suficiente para bloquear la segunda memoria, mientras que ningún estímulo sensibilizante resultó en una segunda memoria fuerte en comparación con los controles naïve (sensibilización: n = 22, no sensibilización después del segundo entrenamiento: n = 24, naïve: n = 30). No hubo aumento de la respuesta a la gamma-nonalactona más allá de los niveles naïve a las 24 h a pesar del bloqueo de la segunda memoria., Los animales que recibieron el segundo entrenamiento sin sensibilización tampoco tuvieron una respuesta significativamente diferente a la gamma-nonalactona en comparación con los controles naïve (sensibilización: n = 22, no sensibilización después del segundo entrenamiento: n = 18, naïve: n = 27). Las gráficas de violín muestran la densidad de datos que se extiende de los valores mínimos a los máximos. Las gráficas de caja internas muestran la mediana y el rango intercuartílico (primer y tercer cuartil). Los bigotes representan valores mínimos a máximos. Los círculos muestran la media. C Línea de tiempo de inyección de anisomicina (ANI) después del segundo entrenamiento apetitivo., d ANI bloqueó la consolidación de la segunda memoria, mientras que la inyección salina resultó en una segunda memoria fuerte (ANI: n = 20, salina: n = 20, naïve: n = 22). ANI después del segundo entrenamiento no recuperó la primera memoria cuando se probó a las 24 h (ANI: n = 20, solución salina: n = 20, naïve: n = 20)
el uso del Protocolo de sensibilización nos permitió concluir que cuando la segunda memoria se bloqueó en su punto de lapso de 2 h, la primera memoria no reapareció., Sin embargo, dado que el bloqueo de la segunda memoria con sensibilización solo se pudo realizar con éxito en el lapso de memoria 2 h después del segundo entrenamiento y solo sabíamos que borraba la segunda memoria cuando se probaba a las 24 h, necesitábamos otro método que bloqueara rápidamente la formación de memoria y llevara al borrado de la segunda memoria en una etapa temprana. Tal método establecería si el bloqueo de solo los primeros procesos de consolidación de la segunda memoria rescataría la primera memoria., Por lo tanto, utilizamos métodos farmacológicos para bloquear la consolidación temprana de la segunda memoria. El tratamiento con el inhibidor traslacional anisomicina (ANI) bloquea rápidamente la síntesis de nuevas proteínas en el cerebro de Lymnaea 32 y su aplicación posterior al entrenamiento impide la expresión de la memoria desde tan pronto como 1 h después del acondicionamiento19, así como su posterior consolidación en la memoria a largo plazo32. Los animales fueron inyectados con ANI o solución salina 10 min después del segundo entrenamiento apetitivo (2 h 10 min después del primer entrenamiento apetitivo) y probados para la memoria a largo plazo (Fig. 5c)., La inyección de ANI sola a las 2 h 10 min no tuvo efecto sobre la expresión de la primera memoria (suplemento Fig. 5e, f) pero había bloqueado con éxito la segunda memoria (Fig. 5d). Sin embargo, esta intervención temprana no logró rescatar la primera memoria (Fig. 5d), lo que indica que de hecho fue interrumpido por el segundo recuerdo dentro de una hora después del segundo entrenamiento. Los animales inyectados con solución salina mostraron la interrupción esperada de la memoria (animales probados con acetato de amilo: ANOVA unidireccional, p < 0.001(F (2,59) = 11.09), prueba de Bonferroni: solución salina vs naïve p < 0.,001, ANI vs saline p <0,01, ANI vs naïve p > 0,05. Animales analizados con Gamma-nonalactona: ANOVA unidireccional, p = 0,75(F (2,57) = 0,295)) (Fig. 5d). Estos experimentos sugieren que la interferencia retroactiva ocurre dentro de una ventana de tiempo temprana después de la adquisición de la segunda memoria. Concluimos que el bloqueo de la segunda memoria no conduce a la expresión de un primer rastro de memoria ‘suprimido’. Por lo tanto, estos experimentos apoyan la conclusión de que, al menos a nivel de comportamiento, la segunda memoria reemplaza efectivamente a la primera memoria.