3.1.2.2. HPLC
HPLC usando fases móviles basadas en acetonitrilo o hexano permite la detección directa de fosfolípidos sin limpieza previa del extracto crudo, haciendo así estos métodos simples y rápidos. Sin embargo, estos métodos no separan eficazmente los diferentes fosfolípidos de inositol. Nakamura et al. (1989) han desarrollado un procedimiento de HPLC que analiza específicamente PtdIns y PtdInsP2 en el cerebro., En este método, el extracto lipídico se derivatiza primero con 9-antrildiazometano para producir(9-antril) PtdInsP y di (9-antril) PtdInsP2 y luego la muestra derivatizada se separa por HPLC con detección UV a 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn y SM no se derivatizan con este reactivo y, por lo tanto, no interfieren con el ensayo (Yamada et al., 1988). Este método es más sensible que el método de detección UV subivatizado para el análisis de los fosfolípidos de inositol.
Low (1990) ha descrito el uso de columnas de celulosa DEAE para HPLC preparativa de lípidos cerebrales., Los fosfolípidos cerebrales disueltos en 50 ml de disolvente a (cloroformo / metanol / H2O, 20:9:1, por vol.) y aplicado a la columna de celulosa (DEAE cellulose, Sigma), que se lava con álcali y ácido hasta la neutralidad. La celulosa DEAE lavada se envasa en una columna de vidrio (2 cm × 38 cm) con accesorios resistentes a los disolventes. A continuación, la columna se eluta a un caudal de 100 ml/h con un gradiente lineal de 11 desde 100% de disolvente a hasta 100% de disolvente B (disolvente a que contiene 0,6 m de acetato de amonio) y se recogen y analizan fracciones de 13-15 ml para determinar el fósforo (Fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Isolation of PtdInsPs from bovine brain by a DEAE-cellulose column chromatography. La fracción de Folch precipitada por metanol lavado con ácido se elutó a partir de una columna de DEAE-celulosa con un gradiente de 100% de disolvente a (cloroformo/mefhanol/H2O, 20:9:1, por vol.) al 100% de disolvente B (disolvente a que contiene 0,6 m de acetato de amonio) y 13-15 ml de fracciones recogidas. Las fracciones fueron analizadas para fósforo orgánico. La recuperación promedio del fósforo orgánico aplicado fue de aproximadamente 90%., El pico eluting en el número de fracción. Veinticinco fue reproducible presente, pero no fue identificado. La composición de los Picos se determinó mediante el análisis de TLC de fracciones agrupadas. Los Picos se identifican como se muestra en la figura.
reproducido de Low (1990) con permiso del editor.
alternativamente, Low (1990) realizó el paso cromatográfico mediante HPLC preparativo utilizando una columna amino. Los fosfolípidos cerebrales se disolvieron en 5 ml de disolvente a y se aplicaron a un caudal de 2.,5 ml/min a una columna amino-NP de 10 mm × 250 mm (sílice esférica de 5 µm con fase ligada a n-propilamina, IBM Instruments, Danbury, CT) con una columna protectora de 4,5 mm × 50 mm equilibrada con disolvente A. La columna se eluta a un caudal de 2,5 ml/min con 25 ml de disolvente a, un gradiente de 125 ml de disolvente A al 100% de disolvente B, y 100 ml de disolvente B al 100%; se recogen fracciones de 5 ml. Las fracciones agrupadas se concentran ajustando a 18 ml con el disolvente a y los fosfolípidos extraídos. La recuperación promedio de fósforo orgánico es del 80%., Se obtuvo una separación completa de PtdIns (90 ml), PtdInsP (150 ml) y PtdInsP2 (160-200 ml) (cromatograma no mostrado). Los PtdIns, sin embargo, se superponen con PtdSer. La composición de los Picos se determinó con TLC de fracciones agrupadas.
Low (1990)también ha descrito una purificación por HPLC de las PtdIns(4)P y PtdIns(4,5) P2 marcadas de plaquetas humanas. El extracto lipídico de las plaquetas se preparó a partir de 60 ml de sangre humana fresca en presencia de metanol precipitado cerebro bovino PtdInsPs como portador, finalmente se vuelve a disolver en 0.,5 1 de disolvente a y aplicado a un caudal de 1 ml/min a una columna amino-NP de 4,5 mm × 250 mm equilibrada en el disolvente A. La columna se eluta con 5 ml de disolvente a (un gradiente lineal de 25 ml del disolvente a al 100% del disolvente B) y 20 ml de disolvente B. se recogen fracciones de un mililitro y se determina la radiactividad mediante recuento de centelleo líquido. La recuperación media de la radiactividad aplicada es de aproximadamente el 70%. Hay una excelente resolución de los tres inositol fosfátidos pero el PtdIns se superpone con PtdOH., Por lo tanto, este procedimiento de HPLC no es adecuado para la preparación de PtdIns ya que PtdOH, que en la mayoría de los tipos celulares es más rápidamente etiquetado por Pi, no se resuelve a partir de él. Es probable que otros fosfolípidos aniónicos como PtdSer se resuelvan mal a partir de Ptdinas por la columna amino-NP, como se observa con el procedimiento DEAE-celulosa.
como se discutió anteriormente, ninguno de los métodos anteriores es eficaz en la separación de los PtdInsPs individuales en forma pura de extractos de tejidos crudos. Por lo tanto, los extractos de lípidos deben procesarse mediante varios pasos cromatográficos., Para este propósito, el extracto se somete primero a cromatografía Sephadex para la separación de los lípidos de los no lípidos en el extracto. La fracción lipídica se vierte en una columna DEAE que se eluta con diferentes disolventes. Los Ptdinsp se recuperan mediante elución con cloroformo / metanol / sal de amonio como paso final de elución. Las fracciones individuales se concentran a 100 µl a 45°C bajo nitrógeno y luego el residuo concentrado se separa más por cromatografía de cartucho-columna, TLC, HPLC u otros procedimientos cromatográficos.,
Singh (1992) ha descrito la extracción y análisis de PtdIns, PtdIns(4)P y PtdIns(4,5)P2 utilizando un cartucho Sep-Pak. Un extracto lipídico total (Folch et al., 1957) de sinaptosomas y microvasos cerebrales de ratas se preparó por primera vez y la primera fracción generada (fracción 1) se recogió y se extrajo para separar fosfolípidos y glicolípidos como se describe por Dugan et al. (1986). La fracción fosfolípida fue sometida a cromatografía DEAE-celulosa (secuencia de separación 4) según lo descrito por Rouser et al. (1969) para purificar aún más los lípidos de inositol., El extracto purificado fue transferido a un cartucho Sep-Pak. Varios lípidos de inositol se elutan de la columna con un gradiente lineal de acetato de amonio y agua desde el 0,5% de acetato de amonio (200 mM) y el 99,5% de agua hasta el 75% de acetato de amonio y el 25% de agua en 60 min a un caudal de 0,5 ml/min (véase el Capítulo 2). El eluato de columna durante 120 min se recolectó en fracciones de 1 ml. Se identificaron diferentes picos utilizando como puntos de referencia los picos PtdIns, PtdIns(4)P y PtdIns(4,5)P2., Las fracciones que contenían lípidos individuales de inositol fueron agrupadas y analizadas por HPLC según lo descrito por Geurts van Kessel et al. (1977). Se detectaron fosfolípidos individuales a 206 nm utilizando un detector de matriz de diodos programado para escanear un rango de 200-350 nm. Singh (1992) ha demostrado una recuperación del 50-90% de PtdIns e InsPs de muestras de cerebro. InsP3 e InsP4 mostraron la recuperación más baja debido a una mala cuantificación en lugar de un método de extracción deficiente. Los métodos de cartucho no se han aplicado para el aislamiento de las PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2 y PtdIns (3,4,5)P3.Cronholm et al., (1992) han descrito el aislamiento de PtdInsPs del páncreas de rata. Cada páncreas se homogeneizó inmediatamente en 3 ml de cloroformo / metanol(1:2, v/v), y se agregaron aproximadamente 3 MBq de PtdIns(4)P O PtdIns (4,5)P2 marcados con 3H junto con 0,6 ml de 1,2 aq. HCl prior to extraction with chloroform, as described by Schacht (1981). Se añadió metanol a los extractos combinados y lavados para producir cloroformo / metanol (3:2, v/v). La solución se aplicó a la columna Lipidex-DEAE, y la mayoría de los lípidos se elutaron con cloroformo / metanol (3:2, v/v) o cloroformo/metanol/agua (3:6:1 por vol.)., Los PtdIns y PtdSer fueron eluidos junto con 0,03 M H3PO4 y el material no identificado con 0,1 M H3PO4. PtdIns (4)P se elutó con 0,25 M H3PO4 y PtdIns(4,5) P2 con 0,5 m H3PO4 como indica la radiactividad elutada. Todas las fracciones se extrajeron con 0,4 ml de agua/ml de eluato. La fase superior estaba de vuelta-extraído con 0,1 vol. de cloroformo. Las fases agrupadas de cloroformo se lavaron con 0,4 vol. de 0,5 m de HCl en 50% aq. metanol. Las fracciones se utilizaron para la determinación de especies moleculares por FAB / MS (Ver más abajo).
Gunnarsson et al., (1997) utilizaron HPLC de fase normal con detección de dispersión de luz evaporativa para el análisis de muestras comerciales de PtdInsPs junto con otros fosfolípidos. Usando un gradiente lineal de a, cloroformo / metanol / amoníaco (50:45:3, por vol.) and B, chloroform/methanol/water/ammonia (25:55:17:3, by vol.)se obtienen picos emergentes tardíos bien resueltos para PtdIns(4)P y PtdIns(4,5) P2. Las curvas de respuesta a la dosis para PtdIns (4)P y PtdIns (4,5)P2 no fueron lineales, lo que es una característica del detector de dispersión de luz (no se muestran los resultados)., Para la mayoría de los propósitos, la técnica de HPLC es superior en resolución, velocidad y conveniencia general al procedimiento de DEAE-celulosa y es el método de elección si el equipo de HPLC está disponible. DEAE-cellulose es barato y la purificación a gran escala podría requerir el uso de este material. El procedimiento de HPLC también es superior a algunos o en todos los aspectos a los procedimientos alternativos para la purificación de polifosfoinositidos, por ejemplo, TLC preparativo o cromatografía de afinidad de neomicina.