observación
gran parte del progreso en microbiología ha dependido del estudio de «cultivos puros».»Estos son cultivos que contienen solo un tipo de célula, idealmente con el cultivo derivado de una sola célula inicial., Desde el desarrollo temprano de los métodos para establecer culturas puras (1), Ha habido muchos ejemplos en los que las culturas que inicialmente se consideraban puras se encontraron posteriormente que contenían dos tipos de microbios. En algunos casos, estos cultivos multiespecies inadvertidos han dado lugar a importantes avances, como el descubrimiento de la transferencia de hidrógeno entre especies (2). Sin embargo, con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación profunda, podría predecirse razonablemente que los contaminantes no detectados en los cultivos ya no serían una preocupación significativa.,
La Cepa PCA de Geobacter sulfurreducens se aisló a mediados de la década de 1990 mediante el uso de técnicas estándar de enriquecimiento y aislamiento que incluyeron la dilución hasta la extinción en medio líquido, seguido de rayas repetidas de colonias aisladas en medio solidificado con agar (3). Esta es la estrategia clásica que se enseña en los libros de texto introductorios de Microbiología más populares (4-6). Posteriormente, se obtuvo la cepa DL1 de G. sulfurreducens por re-extracción adicional de colonias aisladas de PCA (7). Con el desarrollo de métodos para la manipulación genética de G. sulfurreducens (7) y la secuenciación de su genoma (8), G., sulfurreducens se convirtió en la especie Geobacter de elección para el estudio de la fisiología y las nuevas propiedades extracelulares de transferencia de electrones de este género ambientalmente importante (9). La secuenciación inicial del gen 16S rRNA en el cultivo (3), así como la secuenciación del genoma primero a 8 veces (8) y luego a 80 veces (10, 11) de cobertura, indicaron que el cultivo contenía solo una cepa.,
en un intento de evolucionar adaptativamente DL1 para producir más corriente, se inoculó en un sistema bioeléctrico con un ánodo de grafito posicionado en un potencial (-400 mV versus Ag/AgCl) considerado cercano al límite inferior en el que sería posible la generación de corriente a partir de acetato (12). Un aislado obtenido del biofilm del ánodo, designado G., la cepa de sulfurreducens KN400 (12), es superior a la cepa de inóculo en la producción de corriente eléctrica, y esta superioridad se atribuye al menos en parte a su capacidad para producir más «nanohilos microbianos», filamentos de proteínas eléctricamente conductoras que exhiben conductividad eléctrica similar a la metálica (13, 14).
inicialmente se asumió que la cepa KN400 había acumulado una o más mutaciones que mejoraron su capacidad para la transferencia extracelular de electrones., Esto sería análogo a la selección de cepas mutantes durante la evolución adaptativa de la cepa DL1 para el intercambio de electrones con otros organismos (11) o tasas más altas de reducción de óxido de Fe(III) (10). Sin embargo, la genómica comparativa reveló que la secuencia genómica de la cepa KN400 contenía más de 27.270 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) (15). Un tercio de los genes tenía al menos un polimorfismo nucleotídico, y un cuarto tenía un polimorfismo que afectaba la secuencia proteica resultante (15). Basado en tasas de mutación típicas de 6.,3 × 10-9 / bp por generación (16), tomaría más de 1.000 años acumular estas muchas mutaciones en la cepa DL1. Además, no hay ortólogos en la cepa DL1 para 139 de los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma de la cepa KN400, la mayoría de los cuales están más estrechamente relacionados con genes en organismos filogenéticamente diversos (15).
estas consideraciones y el hecho de que los ORF exclusivos de KN400 no se detectaron cuando el cultivo de inóculo fue resecuenciado (10, 11) llevaron a la hipótesis de que KN400 entró en el sistema bioelectroquímico como contaminante., Para evaluar esta posibilidad, la pureza del cultivo DL1 fue evaluada con mayor sensibilidad.
tanto DL1 como KN400 contienen omcS, un gen para un citocromo de superficie externa que tiene una de las proporciones más altas de SNPs (36 SNPs / kb) entre las dos cepas (15). Este gen se amplificó a partir del cultivo DL1 que se había utilizado para inocular el sistema bioelectroquímico, y los productos de PCR se secuenciaron con Illumina Hi-Seq 2000 (Ver texto S1 en el material suplementario)., Se detectó la secuencia KN400, indicando que KN400 estaba presente en el inóculo inicial utilizado para el estudio de selección de ánodos. Sin embargo, de las 107 secuencias recuperadas de alta calidad >, solo 286 fueron secuencias KN400 versus secuencias 1.5 × 107 DL1 (Tabla 1).
Text S1
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estimaciones de la abundancia de la cepa KN400 en varias culturas
tabla S1
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la abundancia relativa de la cepa KN400 en este mismo cultivo fue evaluada por PCR cuantitativa (qPCR) con un conjunto de imprimación específico para un gen encontrado solo en KN400 (ver texto S1 y tabla S1 en el material suplementario) y un conjunto de imprimación que detectó tanto KN400 como DL1 (ver tabla S1 en el material suplementario)., La abundancia relativa de la secuencia específica KN400 fue similar a la de las secuencias omcS KN400 determinadas por el enfoque de secuenciación (Tabla 1). El análisis de secuencias y el ensayo qPCR del cultivo de PCA depositado en ATCC revelaron la presencia de KN400 en una baja abundancia similar (Tabla 1).
intentamos eliminar el raro contaminante KN400 del cultivo DL1 mediante repetidos reescalonamiento de colonias aisladas cultivadas en medio de acetato-fumarato solidificado (7), pero la cepa KN400 continuó persistiendo a baja frecuencia en las colonias aisladas (Tabla 1)., Sin embargo, se obtuvo un cultivo en el que ya no se pudo detectar KN400 en medio líquido de acetato-fumarato (Ver texto S1 en el material suplementario) en el que la dilución más alta con crecimiento se sometió a varias rondas sucesivas de dilución en serie (Tabla 1). Esto demostró que la cepa DL1 no requiere la rara presencia de KN400 para crecer en el medio de acetato-fumarato en el que se mantiene rutinariamente este cultivo.
Cuando KN400 puro y el cultivo DL1 libre de KN400 fueron inoculados en medio de acetato-fumarato en cantidades iguales, DL1 superó a KN400 (Fig., 1a). Esto es consistente con el hallazgo de que cuando las dos cepas se cultivaron por separado, DL1 creció mucho más rápido que KN400 (densidad óptica a 600 nm de 0.04 para KN400 versus 0.65 para DL1 después de 36 h de incubación; ver Fig. S2 en el material suplementario) en el mismo medio. La proporción de KN400 continuó disminuyendo con transferencias consecutivas (1% de inóculo) hasta que la abundancia de KN400 fue comparable a la de los cultivos de PCA y DL1 (véase el texto S1 en el material suplementario). KN400 persistió en este nivel bajo con más transferencias (Fig. 1a).,
figura S2
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crecimiento y actividad de la cepa KN400 bajo diferentes condiciones de crecimiento. a) abundancia relativa de KN400 en transferencias sucesivas de logaritmos medios (inóculo al 1%) de un cultivo iniciado con proporciones iguales de KN400 y DL1. Los resultados son las medias y desviaciones estándar de los cultivos triplicados. B) producción actual cuando se introdujo el cultivo DL1 en la cámara de ánodos de un sistema bioelectroquímico con un ánodo de grafito a -400 mV frente a Ag/AgCl. La cultura libre de KN400 no produjo corriente durante este tiempo., C) abundancia relativa de KN400 en biofilms de ánodos cuando el inóculo inicial fue el cultivo DL1 que posteriormente se encontró que también contenía KN400. Los resultados son las medias y desviaciones estándar de los cultivos triplicados.
los intentos repetidos de hacer crecer el cultivo DL1 libre de KN400 en un ánodo posicionado a -400 mV no tuvieron éxito. Sin embargo, la corriente se produjo fácilmente en otro conjunto de experimentos en los que el cultivo DL1 que contenía KN400 sirvió como inóculo (Fig. 1b)., Un ensayo qPCR de ADN extraído del biofilm del ánodo indicó que el 100% de las secuencias omcS eran KN400 dentro de la segunda transferencia (Fig. 1c). Estos resultados sugirieron que la razón por la cual la KN400 surgió en los ánodos fue que la cepa DL1 no pudo crecer bajo las condiciones impuestas. Sin esta presión selectiva inusual, KN400 habría permanecido sin ser detectado en los cultivos de PCA y DL1, incluso por los métodos de secuenciación de próxima generación actualmente disponibles que teóricamente pueden proporcionar una cobertura mil veces mayor en la secuenciación del genoma.,
los factores que contribuyen a la persistencia a largo plazo de la cepa KN400 a una frecuencia extremadamente baja en el cultivo DL1 siguen siendo un misterio. La importancia de aislar físicamente las células individuales mediante métodos más definitivos que el rayado en medio sólido para establecer cultivos puros ha sido reconocida desde hace algún tiempo (17), y se siguen desarrollando métodos cada vez más sofisticados para lograr esto (18-23)., Sin embargo, los métodos de chapado que han estado en uso durante más de 100 años y se enseñan a todos los estudiantes de Microbiología como procedimientos estándar para obtener cultivos puros (4-6) siguen siendo los más comunes. Los resultados presentados aquí demuestran que sin el aislamiento unicelular, los contaminantes crípticos pueden sobrevivir a muy baja frecuencia en cultivos durante décadas de investigación intensiva y pueden escapar a la detección incluso mediante los métodos de secuenciación más sofisticados disponibles actualmente.,
figura S1
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