Introducción
Ambergris, un conocido producto natural del cachalote , también se encuentra como jetsam en playas de todo el mundo , y ha sido muy apreciado por su utilidad en la industria del perfume . Aunque se ha sostenido durante mucho tiempo que el ámbar gris jetsam recolectado en las playas proviene de cachalotes , se ha publicado poca o ninguna evidencia de esto, y existen distinciones entre dichas muestras y las muestras de ámbar gris tomadas directamente de cachalotes., Por ejemplo, las muestras de ámbar gris jetsam generalmente contienen proporciones mucho mayores de alcohol triterpenoide ambreina y proporciones mucho menores de esteroles que las muestras de ámbar gris de cachalotes . Sin embargo, a la inversa , el ámbar gris jetsam a veces contiene fragmentos de pico de calamar, y dado que los cefalópodos, como el calamar, constituyen el principal componente dietético de los cachalotes, esto se ha citado como evidencia de un origen de los coprolitos jetsam de los cachalotes. Incluso se teoriza que el ámbar gris puede originarse como una secreción patológica del irritante de la quitina del pico del calamar duro ., Sin embargo , otras especies de mamíferos marinos (por ejemplo, los miembros de Globicephala y Ziphiidae) también son depredadores de calamares, y algunos (incluidos los cachalotes enanos y Pigmeos) también se citan como fuentes potenciales de ámbar gris . Por lo tanto, para dilucidar aún más el origen del ámbar gris jetsam, analizamos el ADN de una muestra de ámbar gris recogida de un cachalote varado en los Países Bajos y lo comparamos con secuencias de ADN aisladas de ámbar gris jetsam recogidas en playas de Nueva Zelanda y Sri Lanka.,
El ámbar gris se considera compuesto predominantemente de ambreina debido a su producción de escualeno, un producto metabólico común en muchos organismos . Este proceso puede ser inducido por la influencia microbiana intestinal, y precipita en masas densas y sólidas dentro del colon de la ballena . Las acreciones coprolíticas que resultan son composicionalmente adecuadas para preservar el ADN del colon ya que la ambreina es hidrofóbica y aparentemente resistente a la degradación dentro del ambiente ácido entérico., La evidencia de la datación por radiocarbono ciertamente indica resistencia a la degradación microbiana y la fotodegradación en el medio marino durante hasta un milenio en algunas muestras de ámbar gris jetsam . Planteamos la hipótesis de que tal material podría proporcionar un escondite oportuno para preservar el ADN, incluso después de una exposición prolongada a condiciones perjudiciales en el mar.
Material y métodos
Se analizaron especímenes de ambergris Jetsam del Mar del Norte, el Océano Índico y el Pacífico, representando la distribución global del material ., Tres especímenes de Ambergris jetsam (uno de Sri Lanka, dos de Pitt Island, Nueva Zelanda) fueron muestreados para la extracción de ADN. Un cuarto espécimen se originó a partir de la disección de un cachalote macho varado en diciembre de 2012, en Razende Bol cerca de Texel, Países Bajos. Este último ámbar gris «fresco», de un cadáver confirmado de cachalote, proporcionó una comparación conocida con los especímenes de jetsam con historia biológica no confirmada. Se obtuvieron muestras de ámbar gris y se analizaron para determinar el contenido de ambreina y esteroles fecales en estudios previos .,
la extracción y secuenciación de ADN se llevaron a cabo en el GLOBE Institute, Universidad de Copenhague, en un laboratorio de ADN antiguo dedicado siguiendo estrictos procedimientos para minimizar la contaminación. Se muestrearon aproximadamente 120 mg (figura 1 y tabla 1) para la extracción de ADN. Las muestras se incubaron en un tampón que contenía proteinasa K de 400 µl después de Gilbert et al. a 56 ° C durante 10 h; los sobrenadantes se trataron con un paso fenol–cloroformo siguiendo a Carøe et al., y purificado utilizando columnas de limpieza de ADN Monarch (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) de acuerdo con las directrices del fabricante. Las bibliotecas de doble cadena se construyeron a partir de extractos de ADN siguiendo el mejor protocolo , diseñadas y probadas específicamente para la secuenciación de ADN antiguo y degradado. Las bibliotecas fueron amplificadas e indexadas a través de PCR utilizando PfuTurbo CX Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) de acuerdo con las directrices del fabricante., Los productos se agruparon a concentración equimolar antes de secuenciarlos en una plataforma Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.), utilizando química de lectura de extremo único de 80 bp en el centro nacional danés de secuenciación de ADN de alto rendimiento, Copenhague, Dinamarca.
la Figura 1. Detalles de las muestras de ámbar gris analizadas. a) Mapa de las localidades donde se encontraron originalmente muestras de ámbar gris., (b) las Fotografías que muestran una gran diversidad en las características físicas de ambergris fragmentos: TEXEL151212 (de ballena disecada muestra) fue granulada en la consistencia, mientras que los desechos de muestras superficialmente parecía más densa y heterogénea, y fueron internamente equigranular y significativamente de un color más pálido.
| ejemplo | ubicación | la masa total (g) | analizados masa (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Isla, Nueva Zelandia | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | oeste de Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Países bajos | 83000 | 92 | 93 |
| ejemplo | total retenido lee | promedio retenido longitud de lectura (bp) | total alineados lee (adnmt) | tiempo de cobertura (adnmt) | total alineados lee (de todo el genoma) | tiempo de cobertura (de todo el genoma) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
se realizó un análisis de secuencia en el Centro de computación de alto rendimiento de la Universidad de Copenhague, con archivos FASTQ procesados utilizando la tubería PALEOMIX (V .1.2.13). FastQC v. 0.11.8 se utilizó inicialmente para el control de calidad de los datos de secuencia sin procesar. Los adaptadores fueron recortados usando AdapterRemoval v. 2.3.1, con lecturas inferiores a 25 pb también eliminadas. Las lecturas fueron mapeadas a secuencias de referencia usando BWA, también aplicando mapDamage2.,0 para la cuantificación básica de la degradación, produciendo alineamientos con secuencias de referencias. ANGSD se utilizó entonces para producir secuencias en formato FASTA.
la incertidumbre en torno al origen y los mecanismos biológicos para la producción de ámbar gris nos llevó a considerar múltiples posibles especies candidatas de cetáceos y pinnípedos en el análisis de secuencias. La identidad de la especie fue inferida por el éxito del mapeo y la relación filogenética con 19 especies candidatas de cetáceos y pinnípedos en NCBI RefSeq (ver el material suplementario electrónico)., Estas especies se seleccionaron en base a su potencial idoneidad como mamíferos marinos de buceo profundo que ocupan un nicho ecológico similar al de los cachalotes, para descartar que tales especies estén co-adaptadas para producir ámbar gris. Las secuencias de muestra fueron concatenadas y alineadas usando MAFFT v. 7.392 . Luego se produjeron modelos filogenéticos de árboles en MEGA X utilizando el método de máxima verosimilitud con el modelo de Hasegawa–Kishino–Yano , con distancias estimadas por el enfoque de máxima verosimilitud compuesta (los detalles de todas las secuencias de referencia utilizadas se incluyen en el material suplementario electrónico).,
resultados
los análisis filogenéticos respaldaron inequívocamente el origen de los cachalotes de las cuatro muestras de ámbar gris (figura 2; material electrónico suplementario, figura S1). Del mismo modo, la alineación con el genoma mitocondrial de referencia Physeter macrocephalus de NCBI (NC_002503.2) produjo los resultados de cobertura más altos para todas las muestras de todas las alineaciones realizadas y proporciona una atribución segura, aunque con variaciones significativas en el éxito entre las muestras. La secuenciación de la muestra de un cachalote varado (TEXEL151212) produjo con mucho la cobertura más alta (aprox., 20×) para la mitocondria de cachalote, mientras que una de las muestras de jetsam de la isla Pitt (S. 01) solo produjo aproximadamente 0.2× cobertura (Ver Tabla 2). Las alineaciones con los genomas mitocondriales de referencia de Kogia sima (cachalote enano) y kogia breviceps (cachalote pigmeo) (NC_041303.1, NC_005272.1) también produjeron cobertura (detalles en material electrónico suplementario), aunque muchas regiones funcionales altamente conservadas se comparten entre las especies analizadas, lo que resulta en una alta similitud de secuencias . Sin embargo, la cobertura para las especies de kogiid fue típicamente alrededor de un factor de 10 menos que para Physeter., La alineación con el genoma completo de referencia nuclear de P. macrocephalus (ASM283717v2) también tuvo éxito, aunque esto es más evidente en las comparaciones del número total de lecturas asignadas al genoma. La alineación de Architeuthis dux (calamar gigante ), una reputada presa común de cachalotes (por ejemplo), no tuvo éxito, pero esta no es su presa predominante .
la Figura 2. Modelo de árbol filogenético de máxima verosimilitud generado a partir de secuencias de referencia y muestras alineadas de genomas mitocondriales., Las muestras se encuentran claramente agrupadas con cachalotes (P. macrocephalus) en lugar de cachalotes enanos y Pigmeos (Kogia spp.). Este árbol refleja el modelo de log-verosimilitud más alto, los valores reflejan el porcentaje de árboles calculados en los que se agruparon los taxones asociados, lo que indica confianza en el posicionamiento, y las longitudes de rama miden el número de sustituciones en cada sitio (ver escala). Figura producida en MEGA X . Representaciones de ballenas de: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Un árbol filogenético que incluye las 19 especies candidatas se presenta en material suplementario electrónico, figura S1.
los resultados de MapDamage muestran notablemente poca variación entre muestras que afecta a las transiciones C A T en los extremos de la cadena 5′, aunque existe un mayor porcentaje de transiciones G A A en el extremo 3′ para S. 01 (detalles en material suplementario electrónico, figura S2), lo que indica una posible degradación biomolecular más alta., En general, sin embargo, se ha producido muy poca modificación química, y la distribución de las alteraciones a través de las hebras sigue siendo uniforme y plana.
discusión
Este estudio ha demostrado que tres muestras de ámbar gris jetsam pueden atribuirse con confianza al cachalote a través de la extracción de ADN. Si bien la confirmación de un origen de cachalote para el ámbar gris jetsam no es un resultado sorprendente, el presente estudio es el PRIMERO en proporcionar una prueba de concepto significativa para recuperar el ADN endógeno del ámbar gris y usarlo con éxito para la identificación del organismo., Es importante destacar que el origen de las tres muestras de ámbar gris jetsam estudiadas aquí puede ser identificado con confianza como cachalote sobre la base no solo del éxito de la alineación genética, sino también del modelado de genomas mitocondriales en árboles de relación filogenética, incluso para una gran muestra de taxones de mamíferos marinos de grupos externos., Sin embargo, aunque todas las muestras analizadas aquí se identificaron como originarias de cachalotes, todavía es muy posible que otros mamíferos marinos de buceo profundo estrechamente relacionados (como los cachalotes enanos y Pigmeos) puedan producir ámbar gris y simplemente todavía no se ha registrado que lo hagan hasta la fecha.
la causa predominante de la variación dramática en la cobertura genética observada entre muestras no está clara. Análisis de la degradación del ADN en mapDamage2.,0 muestra poca correlación con las coberturas de alineación, como podría esperarse, y también hay poca variación entre el contenido de ambreina en las muestras que podría esperarse que contribuyan a la preservación diferencial del ADN. La edad exacta de las actuales muestras de jetsam es desconocida, aunque estudios previos han fechado con éxito radiocarbono otras muestras de ámbar gris . Sin embargo , la datación por radiocarbono de muestras relativamente recientes es problemática debido al impacto de las emisiones de combustibles fósiles, y las fechas por radiocarbono desde el aumento de la liberación de carbono antrópico no son confiables., Producir una tasa de degradación consistente para las transiciones de G A A en muestras antiguas fechadas de manera confiable podría, en el futuro, ayudar a una mejor comprensión del daño diferencial del ADN. Otra opción para futuras investigaciones podrían ser Estudios de desamidación de glutamina y racemización de ácido aspártico a partir del análisis de péptidos orgánicos posiblemente también presentes en ámbar gris . Alternativamente, sin embargo, la variación intramuestra en la concentración de ADN y ambreina podría explicar la baja cobertura en la muestra S.,01, mientras que la exposición más reciente al tejido de cachalote sin duda explica la alta cobertura en la muestra de ballena varada TEXEL151212.
el potencial de conservación de los precipitados de ambreina para el ADN se extiende no solo a la genética endógena de las ballenas, sino también a la cobertura metagenómica del microbioma intestinal de las ballenas, y potencialmente también al ADN de sus presas. Por ejemplo, el ADN también puede permanecer dentro de los Picos de calamar parcialmente o no digeridos que se encuentran en las heces de los cachalotes , y en el ámbar gris , que incluso se teoriza que es una causa patológica de la secreción de ámbar gris ., La comprensión de la composición procariótica del ambiente del microbioma en el ámbar gris también podría dilucidar aún más el origen del ámbar gris, particularmente en la conversión del escualeno a ambreina y el proceso por el cual el ámbar gris parece formarse en capas de acreción. Más análisis sobre la recuperación de ADN endógeno de jetsam ambergris, incluyendo también el ADN de la microbiota intestinal de las ballenas y sus presas, producirían una comprensión significativamente mayor de la ecología, la evolución y el metabolismo de los cachalotes.,
conclusión
Jetsam ambergris ha sido durante mucho tiempo un material enigmático, sujeto a discusión y análisis en publicaciones científicas desde el siglo XVIII . Este estudio es el PRIMERO en nuestro conocimiento en presentar la confirmación final del origen biológico de las muestras de ambergris jetsam como cachalotes, a través del análisis de ADN. Más allá de esto, sin embargo, el presente estudio expone el potencial del ámbar gris como una nueva fuente de datos genéticos relacionados con los cachalotes con una longevidad considerable a través del tiempo., Queda por lograr una mayor aclaración mediante el estudio de las condiciones de conservación del ADN en ambreina y de los efectos diferenciales de múltiples factores. Sin embargo, las implicaciones potenciales para ayudar a nuestra comprensión de la dinámica de las poblaciones pasadas en las ballenas y sus taxones asociados ecológicamente pueden ser profundas. El ámbar gris más antiguo encontrado dentro de los depósitos del Pleistoceno presenta picos permineralizados de calamar que contienen aminoácidos endógenos al calamar, que los autores atribuyen a la capacidad de conservación del sedimento local ., Aunque es poco probable que el ADN se conserve para tal edad (1,75 Ma), este hallazgo también podría atribuirse a la eficacia de ambergris y ambreina como sustratos de conservación. Todavía se desconoce mucho sobre la ecología y la adaptación de los gigantes marinos que anteriormente se caracterizaban como bestias semi-míticas, y el ámbar gris Ahora puede resultar una clave pequeña pero significativa para comprender algunos aspectos adicionales de ellos.
ética
todas las muestras fueron obtenidas y analizadas éticamente en este estudio, parte del proyecto DNRF-128 PROTEIOS., De las cuatro muestras de ámbar gris analizadas en este estudio, tres (S. 01–S. 03) fueron submuestreadas a partir de material estudiado por S. J. R. en publicaciones previas (ver más arriba), obtenidas como ámbar gris jetsam encontrado en playas (muestra nos ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 y ACL237-S. 03). La cuarta muestra (TEXEL151212) fue amablemente proporcionada como una submuestra del espécimen de ámbar gris TEXEL151212 por el Dr. A. Oosterbaan en nombre del Museo EcoMare, Texel, Países Bajos, donde el resto de esta muestra todavía se mantiene. Agradecemos el permiso del Museo para utilizar esta muestra.,
la accesibilidad de los Datos
los Autores de las contribuciones de
intereses contrapuestos
declaramos que no tenemos conflictos de intereses.
financiación
la financiación fue proporcionada por la Fundación Nacional de investigación danesa grant PROTEIOS (DNRF128).
agradecimientos
R. M. agradece al Dr. J. A. Samaniego por su asesoramiento en análisis genómicos, y también a M. McCarthy por sus consejos y discusiones. Agradecemos al Dr. A. Oosterbaan (Ecomare Museum, Texel) por la muestra S. 04 y a los coleccionistas anónimos por las muestras S. 01–S. 03., Los autores desean agradecer la asistencia del centro nacional danés de secuenciación de alto rendimiento en la generación de datos Illumina.
notas a pie de Página
el material complementario electrónico puede consultarse en línea en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
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