Telomerstruktur-Funktions-Beziehung
Wie bereits erwähnt, werden Telomere in Abwesenheit von Telomerase nicht funktionsfähig, verkürzen sich mit aufeinanderfolgenden Zellteilungen und Chromosomenabschlüsse können als Folge des Entschutzes verschmelzen. Telomerfusionen sind das Ergebnis einer nicht-homologen Endverbindung (NHEJ), die einer der vorherrschenden Mechanismen einer Doppelstrangbruchheilung (DSB) ist., Das Ergebnis solcher Ereignisse könnte die Schaffung von Chromosomen sein, die mehr als eine Zentromer tragen, die wahrscheinlich während der Mitose zu entgegengesetzten Polen gebündelt werden, was zu Chromosomenbruch und weiterer genomischer Instabilität durch wiederholte Fusionsbruchereignisse führt. Bei Wirbeltieren wird die Rolle des Chromosomenendschutzes, um von Chromosomenbrüchen unterschieden zu werden, einem spezifischen Proteinkomplex zugeschrieben, der gemeinsam als Shelterin bezeichnet wird. Shelterin-Komplex besteht im wesentlichen aus sechs Proteinen., Zwei Mitglieder des Shelterin-Komplexes, TRF1 und TRF2 (von Telomere Repeat-Binding Factor 1 und 2) binden direkt an doppelsträngige telomere Sequenz, während POT1 ssDNA bindet. TRF2 interagiert mit und rekrutiert RAP1, während TIN2 die TPP1 – POT1-Bindung an den TIRF1 / TIRF2-Kernkomplex vermittelt. POT1 bindet und schützt den 3-einzelsträngigen DNA-Überhang von Telomeren (G-Tail), während TIN2 wahrscheinlich die einzel-und doppelsträngigen DNA-Bindungskomplexe verbindet, insbesondere im Bereich der telomeren D-Loop-Bildung (Abbildung 3) ., Es scheint, dass sich dieser Kern-Shelterin-Komplex hauptsächlich am Telomerende befindet (auch als Telosom bezeichnet) und sowohl zur Stabilisierung der T-Loop-Struktur dient als auch gleichzeitig davor schützt, als DNA-Schaden erkannt und von NHEJ repariert zu werden. Darüber hinaus reguliert Shelterin den Zugang zu Wiederherstellungsprozessen der telomeren DNA nach jeder Genomreplikation., Im Allgemeinen scheint der Shelterin-Komplex als Plattform zu fungieren, die die Rekrutierung einer wachsenden Liste von Faktoren reguliert, die an der Chromatin-Remodellierung, DNA-Replikation, DNA-Schadensreparatur, Rekombination und Telomerasefunktion beteiligt sind, wodurch der Telomerzugang / die Telomermodifikation durch verschiedene zelluläre Prozesse reguliert wird (Abbildung 4), kürzlich überprüft in .
Abbildung 3.
Schematisches Modell der potentiellen Telomerverschlussanordnung durch den Shelterin-Komplex., Proteine des Shelterin-Komplexes sind am Telomerschutz, der Replikation und der Längenregulierung beteiligt. TRF1-und TRF2-Proteine binden spezifisch an telomere ds-DNA, während POT1 (TPP1) ssDNA (stabilisierende D-Schleife) erkennt. TIN2 verbindet ssDNA mit dsDNA-Bindungskomplexen und stabilisiert die Telosomenstruktur. Telomere DNA besteht aus sich wiederholender DNA-Sequenz, einer Duplexregion und einem ssDNA-G-Strang-Überhang (G-Strang, orange; C-Strang, blau). Der Shelterin-Komplex bindet sowohl an die Duplex–als auch an die ssDNA-Regionen durch spezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen., Die Bildung der T-Schleife beinhaltet eine Stranginvasion des G-Überhangs, um eine Verschiebungsschleife (D-Schleife) zu erzeugen. Die T-Schleife wird vorgeschlagen, um das Chromosomenende vor DNA-Schadenssensoren zu maskieren. Der Einfachheit halber wird der Shelterin-Komplex als ein Sechs-Protein-Komplex dargestellt, der homogen auf Telomere dispergiert ist. Siehe text für weitere details.
Interessanterweise scheint es, dass mehr als eine Art von Kernschutzkomplex existiert und nicht alle von ihnen notwendigerweise Teil des Telosoms sind. Komplexe, die nur TRF1-TIN2-TPP1-POT1 oder TRF2-RAP1 enthalten, wurden nachgewiesen., Jüngste Daten, die die absoluten und relativen Mengen von TRF1 und TRF2 in der Zelle messen, zeigten, dass TRF2 etwa doppelt so häufig vorkommt wie TRF1, und dies steht im Einklang mit dem Nachweis von TRF2 in räumlich gerichteten DNA-schädigungsinduzierten Foci in nicht-telomeren Chromosomenregionen. Die Rekrutierung von TRF2 an Stellen mit DNA-Schäden stimmt damit überein, dass es eine entscheidende Rolle bei der DNA-Schadensreaktion spielt . Die Komplexität des telosom geschaffenen Netzwerks basiert praktisch auf den einzigartigen strukturellen Merkmalen der Shelterin-Mitglieder., TRF1 und 2 tragen eine SAB/MYB-Domäne, durch die beide ein TTAGGGTTA-Motiv auf telomere ds-DNA, eine saure reiche (D/E) terminale Region und ein spezifisches Docking-Motiv erkennen, das als TRF-Homologie (TRFH) – Motiv bezeichnet wird . Die TRFH-Domäne vermittelt die Homodimerisierung von TRF1 oder TRF2, verbietet jedoch die Heterodimerisierung aufgrund struktureller Einschränkungen . Für die TRF1-und TRF2-Bindung sind ein FxLxP-Motiv und ein Y/FxLxP-Motiv erforderlich. Diese Domänen werden als TRFH Binding Motives (TBM) bezeichnet. Der Phe 142-Aminosäurerest im TRF1-TRFH-Motiv ist für die TIN2-Bindung durch seine TBM-Region verantwortlich., TIN2-TBM weist aufgrund struktureller Unterschiede in der Nähe von Phe 120 eine signifikant geringere Affinität zur entsprechenden Region von TRF2 (Phe 120) auf und ist schließlich über eine einzigartige TRF2-Region nahe dem N-Terminus des Proteins an TRF2 gebunden. Dennoch ist der Phe 120-Rückstand entscheidend für die spezifische Wechselwirkung mit anderen telomerassoziierten Faktoren wie Apollo Nuclease, einem TRF2-Bindungspartner. Die komplexe Bildung zwischen Shelterin-Kernmitgliedern und assoziierten Faktoren mit TBM-ähnlichen Motiven wird wahrscheinlich auch durch Änderungen der Bindungsaffinitäten aufgrund posttranslationaler Modifikationen gesteuert., Ein schönes Beispiel ist die TRF1-Parsylierung durch Tankyrase, was zu einer signifikanten Abnahme der DNA-TRF1-Affinität führt, was eine Telomerverlängerung und eine Trennung der Schwester-Telomere ermöglicht, indem der Komplex spezifisch von TRF1 und TIN2 entlastet wird . Ein Ungleichgewicht solcher Wechselwirkungen könnte sich nachteilig auf die Genomintegrität auswirken, wie erhöhte TIFS-Spiegel zeigen, die in Zellen gebildet werden, die ein isoliertes TBM als Tandem-YRL-Repeat überexprimieren. Analoge schädliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn ein TRF2-F120-Substitutions-Allel exprimiert wurde .,
Neuere strukturelle Untersuchungen einer der beiden OB (Oligonukleotid/Oligosaccharid-Bindung)-Falten von S. pombe Pot1, die die Bindungsstelle von ssDNA umfassen, ergaben, dass die unspezifische Nukleotiderkennung von ssDNA durch bisher nicht identifizierte Bindungsmodi erreicht wird, die Basensubstitutionen durch alternative Stapelwechselwirkungen und neue H-Bonding-Netzwerke thermodynamisch kompensieren . Es wird daher erwartet, dass die detaillierte Abgrenzung der Struktur der Shelterin-Mitglieder und der damit verbundenen Faktoren unser Verständnis der Netzwerke und der Art und Weise geometrisch verbessert Menge vs., qualitätsänderungen stören strukturelle Modifikationen, die zu funktionellen Veränderungen führen und die Genomstabilität fein abstimmen. Zweifellos hat die Fülle der gesammelten Informationen bereits den Weg für die Verwendung von Anti-Telomerase-Mitteln in klinischen Studien geebnet, mit dem erwarteten Ergebnis.
Neben Shelterin und Interaktionspartnern hat sich kürzlich ein weiterer bedeutender Komplex herausgebildet, der sich auch mit der Telomerbiologie beschäftigt, dem CST-Komplex. Der CST-Komplex besteht aus CTC1, STN1 (OBFC1) und TEN1 und wurde der Rettung von stillgelegten Replikationsgabeln während der Replikationsbeanspruchung zugeschrieben., Der CST-Komplex verbindet Telomere unabhängig vom Pot1-Weg mit der Genomreplikation und dem Schutz .
Die Anhäufung von Beweisen durch zahlreiche Veröffentlichungen zeigte unerwartet, dass DNA-Schadensreaktion (DDR) und Reparaturwege, obwohl sie paradox erscheinen, gemeinsame Merkmale mit Telomerwartungsstrategien aufweisen. DDR early response-Proteine rekrutiert werden, um die Telomere und Proteine geglaubt Funktion in der telomererhaltung wurden auch belegt zu werden beteiligt in der DDR., Paradoxerweise scheinen DDR-Faktoren in Telomeren unter normalen Bedingungen die Wiederherstellung des Telomers und die Längenerhaltung zu beeinträchtigen. Dieses ausgeprägte Phänomen wird auf die Koordination der DDR-Faktoren Zugang und Funktion bei Telomeren zurückgeführt. TRF2 kann ATM binden und unterdrücken, während POT1, wenn es durch TPP1 an den G-Schwanz gebunden ist, ATR hemmt. Die Unterdrückung der TRF2-Aktivität löst eine p53-und ATM-Aktivierung aus, was zu telomerinduzierten Foci (TIFs) führt. TIFs führen zu End-to-End-Telomerfusionen über den NHEJ-Weg und ihr Auftreten korreliert mit der Induktion von Seneszenz ., Das Zusammenspiel scheint auf Shelterin-Menge und Telomerlänge zu basieren, zwei Parameter, die in direktem Zusammenhang miteinander stehen, da Telomere, wenn sie kritisch kurz sind, weniger wahrscheinlich eine T-Schleife bilden, eine Reaktion, die durch TRF2 in vitro katalysiert wird, und wiederum weniger Shelterin gebunden ist . Folglich werden zwei große Telomerwartungsstrukturen signifikant reduziert (T-Loop und Shelterin-Beschichtung), was eine DDR-Aktivierung ermöglicht., Interessanterweise kann die NHEJ-Maschinerie jedoch auch eine schützende Rolle bei Telomeren durch die enzymatische Aktivität von Tankyrase im Zusammenhang mit der Förderung der DNA-PKcs-Stabilität und der Verhinderung der Bildung von Telomerschwesterchromatidaustausch (T – SCEs) als Produkt der Inter-Telomerrekombination
Ein weiteres faszinierendes Paradigma ist der MRN-Komplex (ein Proteinkomplex der meiotischen Rekombination 11 (MRE11) – RAD50-und NBS1-Proteine), bei dem ein einzelnes NBS1-Molekül mit der Bildung von zwei Dimere von MRE11 und RAD50 ., Die Proteine MRE11 und RAD50 bilden ein Heterotetramer, das zwei DNA-bindende und verarbeitende Domänen enthält, die freie DNA-Enden überbrücken können . Der MRN-Komplex lokalisiert sich während der S-und G2-Phasen des Zellzyklus durch direkte Wechselwirkung von NBS1 mit TRF2 zu Telomeren, was vermutlich zur G-Tail-Bildung am führenden Telomerstrang und damit zur Telomerstabilität beiträgt ., Beim Menschen führt eine Mutation im NBS1-Gen zu der chromosomalen Instabilitätsstörung, dem Nijmegen – Bruch-Syndrom 1, die mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung und chromosomaler Instabilität und früh entwickelndem Krebs auch bei NBS1+/ – Heterozygoten einhergeht. NBS1 enthält eine Forkhead-assoziierte (FHA), eine BRCT-(BRCA1 C-Terminus) Domäne, eine MRE11-Bindungsdomäne und eine ATM-interagierende Domäne. Akkumulierende Beweise zeigen, dass NBS1 mit Telomeren interagiert und zu ihrer Stabilität beiträgt, zumindest in menschlichen und Mauszellen., Indirekte Immunfluoreszenzexperimente zeigten, dass NBS1 während der S-Phase in kultivierten HeLa-Zellen mit TRF2 co-lokalisiert , möglicherweise durch Modulieren der T-Schleifenbildung. Da TRF2 auch an nicht-telomeren Sequenzen gefunden wurde, bedarf der Einfluss der NBS1-Co-Lokalisierung mit TRF2 einer weiteren Klärung. In ähnlicher Weise wurde in embryonalen Fibroblasten der Maus eine aktive Rekrutierung von NBS1 zu dysfunktionellen Telomeren beobachtet . Der MRN-Komplex scheint eine doppelte Rolle in der Telomerbiologie zu spielen. Eine besteht darin, zumindest teilweise die ATM-Antwort zu vermitteln, die zur TIF-Bildung nach TRF2-Löschung führt ., Zweitens ist es aufgrund seiner Nukleaseaktivität für die normale Telomerbildung erforderlich, da MRN an der Verarbeitung beschädigter Telomere beteiligt ist, indem die Produktion des Überhangs von einem nach der Telomerreplikation erzeugten stumpfen Endtelomer beeinflusst wird . Eine solche Beschleunigung der G-Tail-Formation nach Telomer-Dysfunktion / De-Schutz verhindert die Verschmelzung führender stumpfer Stränge von de-geschützten Telomeren während der S-Phase. Apollo Nuclease kann auch rekrutiert werden und an diesem Prozess beteiligt sein., Es wurde eine direkte Wechselwirkung von NBS1 mit Telomeren-Wiederholungsbindungsfaktor 1 (TRF1) für unsterbliche Telomerase-negative Zellen gezeigt, was impliziert, dass diese Wechselwirkung an der alternativen Verlängerung von Telomeren beteiligt sein könnte. Darüber hinaus kann in Telomerase-exprimierenden Zellen der MRN-Komplex durch Downregulation und Entfernung von TRF1 (NBS1-abhängige Phosphorylierung von TRF1 durch ATM) auch die Zugänglichkeit von Telomerase zum 3-Ende von Telomeren fördern ., DNA-Reparatur Die Interkommunikation mit der Telomerstabilität ist eine Beziehung, die ziemlich früh in der Evolution hergestellt wurde, wie die Tatsache zeigt, dass MRE11 und RAD50 zusammen mit den Proteinkinasen ATM und ATR auch für die ordnungsgemäße Wartung des Telomers in Pflanzen unerlässlich sind .
Abbildung 4.
Shelterin assoziierte Faktoren, die auch an der DNA-Schadensreaktion beteiligt sind., Details im Text
Kürzlich fügt eine weitere Proteinphosphatase, PNUTS (phosphatase 1 nuclear-targeting subunit), die mit TRF2 interagiert, ein weiteres Stück in das Puzzle der DDR-und Telomerbeziehung ein . Darüber hinaus interagiert die drei BRCT-Domänen, die den proximalen DDR-Faktor MCPH1 tragen, durch genomweite Suche nach TBM-haltigen Proteinen mit TRF2. MCPH1-Mutationen sind mit Entwicklungsdefekten und erhöhter Tumorinzidenz verbunden ., MCPH1 erschöpfte Zellen weisen verminderte BRCA1-und Chk1-Spiegel auf und sind im G2/M-Kontrollpunkt defekt .
Eine wesentliche Rolle für die Telomerintegrität wird auch BRCA2 zugeschrieben, einer Schlüsselkomponente des HR-DNA-Reparaturwegs. BRCA2 assoziiert mit Telomeren während der S / G2-Zellzyklusphasen und scheint die RAD51-Rekombinase-Belastung zu erleichtern . Daher ist eine BRCA2-vermittelte HR-Aktivität für die Wartung der Telomerlänge erforderlich. Diese Ergebnisse können zumindest teilweise die kürzeren Telomere erklären, die in BRCA2 mutierten menschlichen Brusttumoren gefunden werden., Daher kann eine Telomerfunktionsstörung auch an der genomischen Instabilität beteiligt sein, die bei Brust-und Eierstockkrebs mit BRCA2-Mangel beobachtet wird .
Insgesamt wurde festgestellt, dass eine Reihe von DNA-Reparaturmolekülen, die gemeinsam Teil der HR -, NHEJ -, NER-und Fanconi-Anämie-Pfade sind, bei Telomeren rekrutiert werden, wobei TRF2 hauptsächlich als Protein-Hub fungiert., Unter normalen Bedingungen ist die ATM / ATR-Signalisierung bei Entschutz aufgrund kurzer Telomerlänge und anschließendem „Ruhestand“ der Zelle (Seneszenz / Apoptose) Teil des normalen, tumorinitiierenden Schutzmechanismus gegen genomdestabilisierte Zellen. In Zellen mit normaler Telomerlänge gibt es inhibitorische Beziehungen zwischen diesen verschiedenen DNA-Reparatursystemen, die die Aktivierung des anderen verhindern.
Telomere sind Teil der Heterochromatinstruktur, was bedeutet, dass spezifische Signale ihre Position im Kern definieren., Obwohl die Tatsache, dass Telomere per Definition stabile und inerte Chromosomenenden sein sollen, dennoch dynamische Nukleoproteinkomplexe zu sein scheinen, die auch an der Chromatin-Remodellierung beteiligt sind. Die Rekrutierung des Heterochromatin-Bindungsproteins HP1, die angereicherte Trimethylierung von Histon – H3-Lysin 9 (H3K9) und H4K20 sowie die Methylierung von CpG-Dinukleotiden in subtelomeren DNA-Wiederholungen unterstützen diesen Begriff. Diese heterochromatischen Markierungen werden durch Eigenschaften von offenem Chromatin ersetzt(erhöhte Acetylierung an Histonschwänzen usw.) wenn Telomere kürzer werden., Solche Änderungen implizieren, dass eine minimale Telomerlänge erforderlich ist, um die heterochromatinähnliche Konformation an Chromosomenenden aufrechtzuerhalten, eine Struktur, die sich nach dem Telomerabrieb ändern kann. Darüber hinaus sollten Telomere und der Shelterin-Komplex ihre enge Struktur während der Chromosomenreplikation lockern und ihre kompakte Form nach Abschluss der DNA-Duplikation wieder herstellen. Eine analoge Lockerung der Telomerstruktur sollte bei Telomerwiederherstellung entweder durch Telomerase-oder DNA-Reparaturmechanismen erforderlich sein, wenn auch möglicherweise durch unterschiedliche Verfahren., Um diese Plastizität zu erreichen, sollte Chromatin durch eine Reihe von Enzymen gemäß einem lokalen Histoncode umgebaut werden . Eine Reihe von Histonmodifikationen sind beteiligt, bei denen unterschiedliche Histonschwanz-Protein-Wechselwirkungen die Entspannung oder Kompression der Telomerkomplexstruktur fördern . Als Beispiel lieferten SIRT6-Depletionsexperimente (eine Histon-H3K9-Deacetylase, die telomeres Chromatin moduliert) durch RNA-Interferenz Hinweise auf eine erhöhte nukleare DNA-Schädigung und die Bildung von Telomerfunktions-induzierten Foci., Diese Experimente deuteten darauf hin, dass SIRT6 Endothelzellen vor Telomerschäden und genomischen DNA-Schäden schützt und so eine Abnahme der Replikationskapazität und den Beginn einer vorzeitigen Seneszenz verhindert, was in diesem speziellen Fall zur Aufrechterhaltung der endothelialen homöostatischen Funktionen und zur Verzögerung der Gefäßalterung beiträgt.
Ein weiterer wichtiger Satz von Faktoren, die mit der Telomerbiologie zusammenhängen, sind die Produkte von ATRX-und DAXX-Genen, die zusammen mit Histon H3.3 an der Chromatin-Remodellierung beteiligt sind ., Mutationen oder Deletionen in diesen genetischen Loci wurden direkt mit dem ALT+ – Status auf Zelllinien oder Tumoren an sich korreliert . Nach diesen Erkenntnissen kann das Screening auf ATRX/DAXX – Mutationen/Expression den aktuell zuverlässigsten Marker für Tumore darstellen, die den ALT – TMM-Weg gewählt haben.,
Gemeinsam ist es die richtige Anordnung von Shelterinen in Telomeren, die für die Chromosomenstabilität (Differenzierung der Chromosomenenden von der DNA) wesentlich ist, und verhindert den Verlust genetischer Informationen entweder durch nukleolytischen Angriff (Exonuklease-vermittelter Abbau) oder aberrante Chromosomenfusionen und unerwünschte Rekombination während der Lebensdauer einer Zelle., Zusammen mit der richtigen Struktur wird die funktionelle Koordination, die die TMM-und Telomeraseaktivität steuert, während des gesamten Zellzyklus streng durch eine Reihe von implizierten Zubehörfaktoren reguliert, die vorübergehend von den Shelterin-Komplexen / Subkomplexen rekrutiert werden .
Abgesehen von ihrer schützenden Rolle ermöglicht die ordnungsgemäße Wechselwirkung von Shelterinen mit Komponenten von DNA-Reparaturmaschinen sowie Telomerase-Komponenten und Telomerase-Rekrutierung gegebenenfalls die Wiederherstellung von Telomeren., Die Bedeutung der korrekten Struktur-Funktion von Shelterin-Komponenten in der Telomerbiologie und Krebsbildung, zusammen mit telomerassoziierten Erkrankungen, werden durch Assoziation des Mutationsnachweises in d.h. TIN2 in vielen dieser Fälle dargestellt .