Einführung
Ambergris, ein bekanntes Naturprodukt des Pottwals, wird auch als Jetsam an Stränden weltweit gefunden und wurde für seinen Nutzen in der Parfümindustrie hoch geschätzt . Obwohl seit langem behauptet wird , dass die Jetsam Ambergris, die an Stränden gesammelt wurden, von Pottwalen stammen, wurden bisher kaum oder gar keine Beweise dafür veröffentlicht, und es gibt Unterschiede zwischen solchen Proben und Proben von Ambergris, die direkt von Pottwalen entnommen wurden., Zum Beispiel enthalten Jetsam Ambergris-Proben im Allgemeinen viel höhere Anteile des Triterpenoidalkohols Ambrein und viel niedrigere Anteile von Sterolen als Proben von Ambergris von Pottwalen . Umgekehrt, Jetsam ambergris enthält manchmal Fragmente von Tintenfischschnäbeln, und da Kopffüßer, wie Tintenfisch, bilden den Hauptbestandteil der Pottwale, Dies wurde als Beweis für einen Ursprung der Jetsam-Koprolithen von Pottwalen angeführt. Es wird sogar vermutet, dass Ambergris als pathologisches Sekret aus dem Reizstoff des harten Tintenfischschnabels Chitin stammen kann ., Andere Meeressäugerarten (z. B. Mitglieder von Globicephala und Ziphiidae) gehen jedoch auch auf Tintenfischen vor , und einige (einschließlich Zwerg-und Zwerg-Pottwale) werden auch als potenzielle Ambergris-Quellen angeführt . Um die Herkunft von Jetsam Ambergris weiter aufzuklären, analysierten wir DNA aus einer Ambergris-Probe, die von einem in den Niederlanden gestrandeten Pottwal entnommen wurde, und verglichen sie mit DNA-Sequenzen, die von Jetsam Ambergris isoliert wurden Strände in Neuseeland und Sri Lanka.,
Ambergris wird aufgrund seiner Produktion aus Squalen, einem in vielen Organismen verbreiteten Stoffwechselprodukt, als überwiegend aus Ambrein zusammengesetzt angesehen . Dieser Prozess kann durch darmmikrobiellen Einfluss induziert werden und fällt in dichten, festen Massen innerhalb des Walkolons aus . Die sich ergebenden koprolitären Akkretionen sind kompositorisch gut geeignet, um DNA aus dem Dickdarm zu erhalten, da Ambrein hydrophob und anscheinend resistent gegen Abbau in der sauren enterischen Umgebung ist., Beweise aus Radiokohlenstoff Dating weist in einigen Jetsam Ambergris-Proben auf eine Resistenz gegen mikrobiellen und Fotodegradation in der Meeresumwelt für bis zu ein Jahrtausend hin . Wir stellten die Hypothese auf, dass solches Material auch nach längerer Exposition gegenüber schädlichen Bedingungen auf See eine günstige Möglichkeit zur Konservierung von DNA bieten könnte.
Material und Methoden
Jetsam ambergris-Proben aus der Nordsee, dem Indischen Ozean und dem Pazifik wurden analysiert und repräsentieren die globale Verteilung des Materials ., Drei Jetsam Ambergris-Proben (eines aus Sri Lanka, zwei aus Pitt Island, Neuseeland) wurden zur DNA-Extraktion untersampliert. Ein viertes Exemplar stammt aus der Dissektion eines männlichen Pottwals, der im Dezember 2012 in Razende Bol bei Texel, Niederlande, gestrandet war. Letzterer „frische“ Ambergris aus einem bestätigten Pottwalkadaver lieferte einen bekannten Vergleich zu den Jetsam-Proben mit unbestätigter biologischer Vorgeschichte. Proben von Ambergris wurden erhalten und in früheren Studien auf Ambrein-und Fäkalsterolgehalt analysiert .,
Die DNA-Extraktion und-sequenzierung wurde am GLOBE Institute der Universität Kopenhagen in einem speziellen alten DNA-Labor nach strengen Verfahren zur Minimierung der Kontamination durchgeführt. Ungefähr 120 mg wurden zur DNA-Extraktion untersampliert (Abbildung 1 und Tabelle 1). Die Proben wurden in 400 µl Proteinase K-haltigem Puffer nach Gilbert et al inkubiert. bei 56°C für 10 h; überstände wurden dann behandelt mit einer phenol–chloroform-Schritt nach Carøe et al., und gereinigt mit Monarch DNA-aufreinigungssäulen (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) gemäß den Richtlinien des Herstellers. Doppelsträngige Bibliotheken wurden nach dem BESTEN Protokoll aus DNA-Extrakten erstellt, die speziell für die Sequenzierung antiker und abgebauter DNA entwickelt und bewährt wurden. Bibliotheken wurden verstärkt und indiziert durch PCR mit PfuTurbo Cx Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) gemäß den Richtlinien des Herstellers., Die Produkte wurden vor der Sequenzierung auf einer Illumina HiSeq 4000-Plattform (Illumina, San Diego, CA, USA) mit 80 bp Single-End-Read-Chemie im dänischen Nationalen DNA-Sequenzierungszentrum mit hohem Durchsatz, Kopenhagen, Dänemark, in äquimolarer Konzentration gebündelt.
Abbildung 1. Details für ambergris Proben analysiert. a) Karte mit Orten, an denen ursprünglich Ambergris-Proben gefunden wurden., (b) Fotografien, die eine hohe Vielfalt an physikalischen Eigenschaften von Ambergris-Fragmenten zeigen: TEXEL151212 (aus sezierten Walproben) war körnig in der Konsistenz, während Jetsam-Proben oberflächlich dichter und heterogener erschienen und innerlich äquigranular und signifikant blasser in der Farbe waren.
| sample | location | Gesamtmasse (g) | Gesamtmasse (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Island, Neuseeland | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | west Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Niederlande | 83000 | 92 | 93 |
| sample | insgesamt beibehalten liest | durchschnitt beibehalten lesen länge (bp) | insgesamt ausgerichtet liest (mtDNA) | zeiten der abdeckung (mtDNA) | insgesamt ausgerichtete liest (ganze genom) | zeiten der abdeckung (ganze genom) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72,9 | 43 | 0,175 | 12 782 | 0,0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71,7 | 2440 | 1,648 | 2640 | 0,000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62,6 | 71 190 | 19,654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
Auf der Hochleistungsrechenanlage der Universität Kopenhagen wurde eine Sequenzanalyse durchgeführt, wobei FASTQ-Dateien mithilfe der PALEOMIX-Pipeline verarbeitet wurden (v. 1.2.13) . FastQC v. 0.11.8 wurde ursprünglich zur Qualitätskontrolle von rohen Sequenzdaten verwendet. Adapter wurden mit AdapterRemoval v. 2.3.1 getrimmt, wobei auch Lesevorgänge unter 25 bp entfernt wurden. Lesevorgänge wurden dann mit BWA auf Referenzsequenzen abgebildet, wobei auch mapDamage2 angewendet wurde.,0 für die grundlegende Degradationsquantifizierung, wobei Ausrichtungen mit Referenzsequenzen erzeugt werden. ANGSD wurde dann verwendet, um Sequenzen im FASTA-Format zu erzeugen.
Die Unsicherheit über den Ursprung und die biologischen Mechanismen zur Herstellung von Ambergris veranlasste uns, mehrere mögliche Kandidatenwale und Pinniped-Arten in der Sequenzanalyse zu berücksichtigen. Die Artenidentität wurde durch den Kartierungserfolg und die phylogenetische Beziehung zu 19 Cetacean-und Pinniped-Kandidatenarten in NCBI RefSeq abgeleitet (siehe elektronisches Ergänzungsmaterial)., Diese Arten wurden basierend auf der potenziellen Eignung als tieftauchende Meeressäuger ausgewählt, die eine ähnliche ökologische Nische wie Pottwale füllen, um auszuschließen, dass solche Arten zur Produktion von Ambergris gemeinsam angepasst werden. Beispielsequenzen wurden mit MAFFT v. 7.392 verkettet und ausgerichtet . Phylogenetische Baummodelle wurden dann in MEGA X unter Verwendung der Maximum-Likelihood–Methode mit dem Hasegawa–Kishino-Yano-Modell hergestellt , wobei die Entfernungen durch den Maximum-Likelihood-Ansatz geschätzt wurden (Details aller verwendeten Referenzsequenzen sind im elektronischen Ergänzungsmaterial enthalten).,
Ergebnisse
Die phylogenetischen Analysen stützten eindeutig die Herkunft der vier Ambergris-Proben durch den Pottwal (Abbildung 2; elektronisches Ergänzungsmaterial, Abbildung S1). Ebenso ergab die Ausrichtung auf das Physeter macrocephalus mitochondriale Referenzgenom von NCBI (NC_002503.2) die höchsten Abdeckungsergebnisse für alle Proben aller vorgenommenen Ausrichtungen und liefert eine sichere Zuordnung, wenn auch mit signifikanten Erfolgsschwankungen zwischen den Proben. Sequenzierung der Probe von einem gestrandeten Pottwal (TEXEL151212) mit Abstand die höchste Abdeckung (ca., 20×) für Pottwal-Mitochondrion, während eine der Jetsam-Proben von Pitt Island (S. 01) nur etwa 0,2× Abdeckung ergab (siehe Tabelle 2). Ausrichtungen mit Kogia sima (Zwerg-Pottwal) und Kogia breviceps (pygmy sperm whale) Referenz mitochondriale Genome (NC_041303.1, NC_005272.1) auch ergaben die Abdeckung (details in electronic supplementary material), obwohl viele der hoch konservierten funktionellen Regionen sind gemeinsam zwischen den analysierten Arten, was eine hohe Sequenz-ähnlichkeit . Die Abdeckung für Kogiid-Arten war jedoch typischerweise um den Faktor 10 geringer als für Physeter., Die Ausrichtung mit dem P. macrocephalus whole nuclear Reference genome (ASM283717v2) war ebenfalls erfolgreich, obwohl dies bei Vergleichen der Gesamtzahl der Lesevorgänge, die dem Genom zugeordnet sind, deutlicher wird. Die Ausrichtung auf Architeuthis Dux (Riesenkalmar), eine angebliche gemeinsame Beute von Pottwalen (z. B. ), war erfolglos, aber dies ist nicht ihre vorherrschende Beute .
Abbildung 2. Maximum-likelihood-Stammbaum-Modell, generiert aus den Referenz-Sequenzen ausgerichtet und Probe mitochondrialen Genome., Die Proben sind eindeutig als Gruppierung mit Pottwalen (P. macrocephalus) und nicht mit Zwerg-und Zwerg-Pottwalen (Kogia spp.). Dieser Baum spiegelt das Modell mit der höchsten Protokollwahrscheinlichkeit wider, Werte geben den Prozentsatz der berechneten Bäume an, in denen die zugehörigen Taxa gruppiert wurden, was das Vertrauen in die Positionierung anzeigt, und Verzweigungslängen messen die Anzahl der Substitutionen an jedem Standort (siehe Skala). Abbildung produziert in MEGA X. Whale Darstellungen aus: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg,., Ein phylogenetischer Baum, der alle 19 Kandidatenarten umfasst, ist in elektronischem Ergänzungsmaterial dargestellt, Abbildung S1.
Die Ergebnisse von MapDamage zeigen bemerkenswert geringe Variationen zwischen den Proben, die C-zu-T-Übergänge an den 5′ – Strangenden beeinflussen, obwohl für S. 01 ein höherer Prozentsatz von G-zu-A-Übergängen besteht (Details im elektronischen Ergänzungsmaterial, Abbildung S2), was auf einen möglichen höheren biomolekularen Abbau hinweist., Im Allgemeinen ist jedoch nur sehr wenig chemische Modifikation aufgetreten, und die Verteilung der Veränderungen über Stränge bleibt gleichmäßig und flach.
Diese Studie hat gezeigt, dass drei Jetsam Ambergris-Proben durch DNA-Extraktion sicher dem Pottwal zugeschrieben werden können. Während die Bestätigung eines Pottwalursprungs für Jetsam Ambergris kein überraschendes Ergebnis ist, ist die vorliegende Studie die erste, die einen signifikanten Proof-of-Concept bei der Gewinnung endogener DNA aus Ambergris liefert und diese erfolgreich zur Identifizierung von Organismen verwendet., Wichtig ist, dass der Ursprung aller drei Jetsam Ambergris-Proben, die hier untersucht wurden, auf der Grundlage nicht nur des Erfolgs der genetischen Ausrichtung, sondern auch der Modellierung von mitochondrialen Genomen in phylogenetischen Verwandtschaftsbäumen, einschließlich einer großen Probe von Außergruppen-Meeressäuger-Taxa, sicher als Pottwal identifiziert werden kann., Obwohl alle hier analysierten Proben als von Pottwalen stammend identifiziert wurden, ist es immer noch gut möglich, dass andere eng verwandte tieftauchende Meeressäuger (wie Zwerg-und Zwerg-Pottwale) Ambergris produzieren und bisher einfach noch nicht registriert wurden.
Die Hauptursache für die dramatische Variation der genetischen Abdeckung zwischen den Proben ist unklar. Analyse des DNA-Abbaus in mapDamage2.,0 zeigt wenig Korrelation mit Alignment-Deckungen, wie zu erwarten, und es gibt auch wenig Variation zwischen Ambrein-Gehalt in Proben, von denen erwartet werden könnte, dass sie zur differenziellen DNA-Erhaltung beitragen. Das genaue Alter der vorliegenden Jetsam-Proben ist unbekannt, obwohl frühere Studien andere Ambergris-Proben erfolgreich mit Radiokohlenstoff datiert haben . Jedoch, Radiokohlenstoff Dating relativ neuer Proben ist aufgrund der Auswirkungen der Emissionen fossiler Brennstoffe problematisch , und Radiokohlenstoffdaten seit der Zunahme der Freisetzung anthropischen Kohlenstoffs sind unzuverlässig., Die Erzeugung einer konsistenten Abbaurate für G zu A Übergänge in zuverlässig datierten älteren Proben könnte, in Zukunft, ein besseres Verständnis der differentiellen DNA-Schädigung unterstützen. Eine weitere Option für zukünftige Forschungen könnten Studien zur Glutamin-Desamidierung und Asparaginsäure-Racemisierung aus der Analyse organischer Peptide sein, die möglicherweise auch in Ambergris vorhanden sind . Alternativ, jedoch, Variationen innerhalb der Probe in der DNA-und Ambreinkonzentration könnten ebenso wahrscheinlich für eine geringe Abdeckung in der Probe S verantwortlich sein.,01, während die neuere Exposition gegenüber Pottwalgewebe zweifellos für die hohe Abdeckung in der Bleichwalprobe TEXEL151212 verantwortlich ist.
Das Konservierungspotential von Ambrein-Niederschlägen für DNA erstreckt sich nicht nur auf die endogene Walgenetik, sondern auch auf die metagenomische Abdeckung des Waldarmmikrobioms und möglicherweise auch auf die DNA ihrer Beute. Zum Beispiel kann DNA auch in teilweise oder unverdauten Tintenfischschnäbeln verbleiben , die in Pottwalfäkalien und in Ambergris gefunden werden , von denen sogar angenommen wird, dass sie eine pathologische Ursache für die Ambergris-Sekretion sind ., Das Verständnis der prokaryotischen Zusammensetzung der Mikrobiomumgebung in Ambergris könnte auch den Ursprung von Ambergris weiter aufklären, insbesondere bei der Umwandlung von Squalen in Ambrein und dem Prozess, durch den sich Ambergris in Akkretionsschichten zu bilden scheint. Weitere Analysen zur endogenen DNA-Gewinnung von Jetsam Ambergris, darunter auch DNA aus Wal-Darm-Mikrobiota und Beute, würden deutlich bessere Einblicke in die Ökologie, Evolution und den Stoffwechsel von Pottwalen liefern.,
Schlussfolgerung
Jetsam ambergris ist seit langem ein rätselhaftes Material, das seit dem 18 . Diese Studie ist die erste unseres Wissens, die eine endgültige Bestätigung des biologischen Ursprungs von Jetsam Ambergris-Proben als Pottwale durch DNA-Analyse liefert. Darüber hinaus legt die vorliegende Studie jedoch das Potenzial von Ambergris als neue Quelle genetischer Daten in Bezug auf Pottwale mit einer beträchtlichen Langlebigkeit im Laufe der Zeit dar., Eine größere Aufklärung bleibt durch die Untersuchung der Konservierungsbedingungen der DNA in Ambrein und der Differentialeffekte mehrerer Faktoren zu erreichen. Die möglichen Auswirkungen auf die Unterstützung unseres Verständnisses der vergangenen Bevölkerungsdynamik bei Walen und ihrer ökologisch verbundenen Taxa können jedoch tiefgreifend sein. Die ältesten bekannten Ambergris, die in Pleistozän-Ablagerungen gefunden wurden, weisen permineralisierte Tintenfischschnäbel auf, die Aminosäuren enthalten, die für Tintenfische endogen sind, was die Autoren der Konservierungskapazität des lokalen Sediments zuschreiben ., Obwohl es unwahrscheinlich ist, dass DNA für ein solches Alter konserviert wird (1, 75 Ma), könnte dieser Befund auch auf die Wirksamkeit von Ambergris und Ambrein als Konservierungssubstrate zurückzuführen sein. Über die Ökologie und Anpassung der Meeresriesen, die früher als halbmythische Tiere charakterisiert wurden, ist noch viel unbekannt, und Ambergris kann sich jetzt als kleiner, aber bedeutender Schlüssel zum Verständnis einiger weiterer Aspekte von ihnen erweisen.
Ethik
Alle Proben wurden in dieser Studie, die Teil des DNRF-128 PROTEIOS-Projekts ist, ethisch erhalten und analysiert., Von den vier in dieser Studie analysierten Ambergris–Proben wurden drei (S. 01-S. 03) aus Material entnommen, das von S. J. R. in früheren Veröffentlichungen (siehe oben) untersucht wurde und als Jetsam Ambergris an Stränden erhalten wurde (Beispielnummern ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 und ACL237-S. 03). Die vierte Probe (TEXEL151212) wurde freundlicherweise von Dr. A. Oosterbaan im Auftrag des EcoMare Museums, Texel, Niederlande, zur Verfügung gestellt, wo der Rest dieser Probe noch aufbewahrt wird. Wir sind dankbar für die Erlaubnis des Museums, dieses Muster zu verwenden.,
Daten Erreichbarkeit
Beiträge der Autoren
Konkurrierende Interessen
Wir erklären, wir haben keine Interessenskonflikte.
Die Finanzierung
Die Finanzierung wurde von der dänischen Nationalen Forschungsstiftung grant PROTEIOS (DNRF128) bereitgestellt.
Danksagungen
R. M. ist Dr. J. A. Samaniego für Ratschläge zu genomischen Analysen und auch M. McCarthy für Ratschläge und Diskussionen dankbar. Wir danken Dr. A. Oosterbaan (Ecomare Museum, Texel) für Sample S. 04 und anonymen Sammlern für Samples S. 01–S. 03., Die Autoren möchten die Unterstützung des dänischen Nationalen Zentrums für Hochdurchsatzsequenzierung bei der Erzeugung von Illumina-Daten anerkennen.
Fußnoten
Elektronisches Ergänzungsmaterial ist online verfügbar unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
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