Observation
meget af fremskridtene inden for mikrobiologi har afhang af undersøgelsen af “rene kulturer.”Dette er kulturer, der kun indeholder en type celle, ideelt med kulturen afledt af en indledende enkeltcelle., Fra den tidlige udvikling af metoder til etablering af rene kulturer (1) har der været mange eksempler på, at kulturer, der oprindeligt blev betragtet som rene, efterfølgende viste sig at indeholde to typer mikrober. I nogle tilfælde har disse utilsigtede multiartskulturer ført til vigtige gennembrud, såsom opdagelsen af hydrogenoverførsel mellem arter (2). Imidlertid, med fremkomsten af dybe sekventeringsteknologier, det kan med rimelighed forudsiges, at uopdagede forurenende stoffer i kulturer ikke længere ville være en betydelig bekymring.,
Geobacter sulfurreducens stamme PCA blev isoleret i midten af 1990’erne ved hjælp af standard berigelse og isolation teknikker, der medfølger fortynding til udslettelse i flydende medie, efterfulgt af gentagne striber af isolerede kolonier på agar-størknede mellemlang (3). Dette er den klassiske strategi undervist i de mest populære indledende mikrobiologi lærebøger (4-6). Senere blev G. svovlreducens stamme DL1 opnået ved yderligere restreaking af isolerede PCA kolonier (7). Med udviklingen af metoder til genetisk manipulation af G. svovlreducerer (7) og sekventering af dets genom (8), G., svovlreducens blev den valgte Geobacter-art til studiet af fysiologi og nye ekstracellulære elektronoverførselsegenskaber for denne miljømæssigt vigtige Slægt (9). Indledende sekventering af 16S rRNA-genet i kulturen (3) såvel som sekventering af genomet først til 8 gange (8) og derefter til 80 gange (10, 11) dækning indikerede, at kulturen kun indeholdt en stamme.,
I et forsøg på at adaptivt udvikle sig DL1 til at producere mere strøm, det blev podet ind i en bioelektriske system med en grafit anode balancerer på en potentiel (-400 mV vs. Ag/AgCl), der anses for at være i nærheden af den nedre grænse, hvor den nuværende generation fra acetat ville være muligt (12). Et isolat opnået fra anoden biofilm, betegnet G., sulfurreducens stamme KN400 (12), er superior til inokulum stamme i at producere elektrisk strøm, og denne overlegenhed skyldes ikke mindst dets evne til at producere mere “mikrobiel nanotråde,” elektrisk ledende protein, fibre, der udviser metallic-ligesom et elektrisk ledningsevne (13, 14).
det blev oprindeligt antaget, at stamme KN400 havde akkumuleret en eller flere mutationer, der forbedrede dens kapacitet til ekstracellulær elektronoverførsel., Dette ville være analogt med udvælgelsen for mutante stammer under adaptiv udvikling af stamme DL1 til elektronudveksling med andre organismer (11) eller højere hastigheder af Fe(III) O .idreduktion (10). Sammenlignende genomics afslørede imidlertid, at genomsekvensen af stamme KN400 indeholdt mere end 27.270 enkelt nukleotidpolymorfier (SNP ‘ er) (15). En tredjedel af generne havde mindst en nukleotidpolymorfisme, og en fjerdedel havde en polymorfisme, der påvirkede den resulterende proteinsekvens (15). Baseret på typiske mutationshastigheder på 6.,3 10 10-9 / bp per generation (16), ville det tage mere end 1.000 år at akkumulere disse mange mutationer i stamme DL1. Endvidere er der ingen ortologer i DL1-stammen for 139 af de åbne læserammer (ORFs) i kn400-stammegenomet, hvoraf de fleste er mest beslægtede med gener i fylogenetisk forskellige organismer (15).
Disse overvejelser og det faktum, at ORFs unikke for KN400 ikke blev registreret, når de podekultur var resequenced (10, 11) førte til den hypotese, at KN400 indtastet bioelectrochemical system, som et forurenende stof., For at evaluere denne mulighed blev renheden af DL1-kulturen yderligere vurderet med endnu højere følsomhed.
Både DL1 og KN400 indeholder omcS, et gen for en ydre overflade cytokrom, der har en af de højeste andele af SNPs (36 SNPs/kb) mellem de to stammer (15). Dette gen blev forstærket fra DL1-Kulturen, der var blevet brugt til at inokulere det bioelektrokemiske system, og PCR-produkterne blev sekventeret med Illumina Hi-SE.2000 (Se tekst S1 i det supplerende materiale)., Kn400-sekvensen blev detekteret, hvilket indikerer, at KN400 var til stede i det oprindelige inokulum, der blev anvendt til anodeudvælgelsesundersøgelsen. Af >107 sekvenser af høj kvalitet, der blev genvundet, var kun 286 KN400-sekvenser mod 1, 5.107 DL1-sekvenser (tabel 1).
Sms-S1
Dette er et open-access artikel distribueres i henhold til vilkårene i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported licens, der tillader uindskrænket ikke-kommerciel brug, distribution og reproduktion i ethvert medium, forudsat at den originale forfatter og kilde er krediteret.,
- Vis inline
- Vis popup
Estimater af stamme KN400 overflod i forskellige culturesa
Tabel S1
Dette er en open access-artikel distribueret under betingelserne i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.,0 Unported Licens, som tillader ubegrænset ikke-kommerciel brug, distribution og reproduktion i ethvert medium, forudsat at den oprindelige forfatter og kilde krediteres.
Den relative tæthed af KN400 stamme i denne samme kultur blev yderligere vurderet af kvantitativ PCR (qPCR) med et primersæt, der er specifikke for et gen, som kun findes i KN400 (se Tekst S1 og Tabel S1 i den supplerende materiale) og et primersæt, der opdages, både KN400 og DL1 (se Tabel S1 i den supplerende materiale)., Den relative forekomst af den KN400-specifikke sekvens svarede til den for KN400 omcS-sekvenserne bestemt ved sekventeringsmetoden (tabel 1). Sekvensanalyse og assaypcr-assay af PCA-kulturen deponeret ved ATCC afslørede tilstedeværelsen af KN400 ved en lignende lav overflod (tabel 1).
Vi forsøgte at fjerne den sjældne KN400-forurening fra DL1-kulturen ved gentagen restreaking af isolerede kolonier dyrket på størknet acetat-fumaratmedium (7), men kn400-stammen fortsatte med at vedvare ved en lav frekvens i de isolerede kolonier (tabel 1)., Imidlertid blev en kultur, hvori KN400 ikke længere kunne påvises, opnået i flydende acetat-fumaratmedium (se tekst S1 i det supplerende materiale), hvor den højeste fortynding med vækst blev underkastet flere på hinanden følgende runder seriel fortynding (tabel 1). Dette viste, at DL1-stammen ikke kræver den sjældne tilstedeværelse af KN400 for at vokse i acetat-fumaratmediet, hvorpå denne kultur rutinemæssigt opretholdes.
Når ren KN400 og den KN400-frie DL1-kultur blev inokuleret i acetat-fumaratmedium i lige store mængder, udkonkurrerede DL1 KN400 (fig., 1a). Dette stemmer overens med konstateringen af, at når de to stammer blev dyrket separat, voksede DL1 meget hurtigere end KN400 (optisk densitet ved 600 nm 0,04 for KN400 versus 0,65 for DL1 efter 36 timers inkubation; se Fig. S2 i det supplerende materiale) i samme medium. Andelen af KN400 fortsatte med at falde med på hinanden følgende overførsler (1% inokulum), indtil den overflod af KN400 var sammenlignelig med, at der i PARTNERSKABS-og samarbejdsaftalen og DL1 lager kulturer (se Tekst-S1 i den supplerende materiale). KN400 fortsatte på dette lave niveau med yderligere overførsler (Fig . 1a).,
Figur S2
Dette er et open-access artikel distribueres i henhold til vilkårene i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported licens, der tillader uindskrænket ikke-kommerciel brug, distribution og reproduktion i ethvert medium, forudsat at den originale forfatter og kilde er krediteret.,
Vækst og aktivitet af stamme KN400 under forskellige vækstbetingelser. (a) relativ forekomst af KN400 i successive mid-log overførsler (1% inokulum) af en kultur indledt med lige store andele af KN400 og DL1. Resultaterne er de midler og standardafvigelser af tre eksemplarer kulturer. (B) nuværende produktion, når DL1-kulturen blev indført i anodekammeret i et bioelektrokemisk system med en grafitanode, der er klar ved -400 mV versus Ag/AgCl. Den KN400-frie kultur producerede ingen strøm i løbet af denne tid., (C) Relativ forekomst af KN400 i anodebiofilm, når det oprindelige inokulum var DL1-Kulturen, der efterfølgende blev fundet at indeholde KN400. Resultaterne er de midler og standardafvigelser af tre eksemplarer kulturer.
gentagne forsøg på at dyrke den KN400-frie DL1-kultur på en anode, der var klar til -400 mV, var ikke succesrige. Imidlertid blev strømmen let produceret i et andet sæt eksperimenter, hvor DL1-kulturen indeholdende KN400 tjente som inokulum (fig. 1b)., En DNAPCR-analyse af DNA ekstraheret fra anoden biofilm indikerede, at 100% af omcS-sekvenserne var KN400 inden for den anden overførsel (fig. 1c). Disse resultater antydede, at grunden til, at KN400 dukkede op på anoderne, var, at DL1-stammen ikke var i stand til at vokse under de pålagte betingelser. Uden dette usædvanlige selektive tryk ville KN400 have været uopdaget i PCA-og DL1-kulturerne, selv ved i øjeblikket tilgængelige næste generations sekventeringsmetoder, der teoretisk kan give tusindfoldig dækning i genomsekvensering.,
de faktorer, der bidrager til den langsigtede persistens af stamme KN400 ved ekstremt lav frekvens i DL1-kulturen, forbliver et mysterium. Betydningen af fysisk isolering af enkeltceller ved metoder, der er mere definitive end striber på fast medium for at etablere rene kulturer, er blevet anerkendt i nogen tid (17), og stadig mere sofistikerede metoder til at opnå dette fortsætter med at blive udviklet (18-23)., De platingmetoder, der har været i brug i mere end 100 år og undervises til alle mikrobiologistuderende som standardprocedurer for opnåelse af rene kulturer (4-6), forbliver dog de mest almindelige. Resultaterne præsenteret her viser, at uden enkeltcelleisolering, kryptiske forurenende stoffer kan overleve ved meget lav frekvens i kulturer gennem årtier med intensiv undersøgelse og kan undslippe detektion ved selv de mest sofistikerede sekventeringsmetoder, der i øjeblikket er tilgængelige.,
Figur S1
Dette er et open-access artikel distribueres i henhold til vilkårene i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported licens, der tillader uindskrænket ikke-kommerciel brug, distribution og reproduktion i ethvert medium, forudsat at den originale forfatter og kilde er krediteret.,