3.1.2.2. HPLC
HPLC anvendelse af acetonitril – eller he .anbaserede mobile faser muliggør direkte påvisning af phospholipider uden forudgående oprydning af råekstraktet, hvilket gør disse metoder enkle og hurtige. Disse metoder adskiller imidlertid ikke effektivt de forskellige inositolphospholipider. Nakamura et al. (1989) har udviklet en HPLC-procedure, der specifikt analyserer ptdiner og ptdinsp2 i hjernen., I denne metode, fedtekstrakt er første derivatized med 9-anthryldiazomethane til at producere (9-anthryl) PtdInsP og di(9-anthryl) PtdInsP2 og så derivatized prøve er adskilt ved HPLC med UV-detektion på 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn og SM er ikke derivatiseret med dette reagens og forstyrrer derfor ikke assayet (Yamada et al., 1988). Denne metode er mere følsom end den underivatiserede UV-detektionsmetode til analyse af inositolphospholipider.
lav (1990) har beskrevet brugen af DEAE cellulosekolonner til præparativ HPLC af hjernelipider., Hjernens phospholipider opløst i 50 ml opløsningsmiddel a (chloroform/methanol/ H2O, 20: 9:1, af vol.(DEAE cellulose, Sigma), som vaskes med alkali og syre til neutralitet. Den vaskede DEAE cellulose pakkes i en glassøjle (2 cm 38 38 cm) med opløsningsmiddelbestandige fittings. Kolonnen elueres derefter med en strømningshastighed på 100 ml / time med 1 1 lineær gradient fra 100% opløsningsmiddel A til 100% opløsningsmiddel B (opløsningsmiddel a indeholdende 0,6 m ammoniumacetat), og 13-15 ml fraktioner opsamles og analyseres for fosfor (fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Isolering af ptdinsps fra kvæghjerne ved hjælp af en DEAE-cellulose-søjlekromatografi. Syre vaskes methanol-fældet Folch Fraktion blev elueres fra en DEAE-cellulose kolonne med en gradient på 100% Opløsningsmiddel A (chloroform/mefhanol/H2O, 20:9:1, vol.) til 100% opløsningsmiddel B (opløsningsmiddel a indeholdende 0,6 m ammoniumacetat) og 13-15 ml fraktioner opsamlet. Fraktionerne blev analyseret for organisk fosfor. Den gennemsnitlige genfinding af anvendt organisk fosfor var ca. 90%., Toppen eluerer ved fraktionsnummer. Femogtyve var reproducerbart til stede, men blev ikke identificeret. Sammensætningen af toppene blev bestemt ved TLC-analyse af poolede fraktioner. Toppe er identificeret som vist i figuren.gengivet fra lav (1990) med tilladelse fra publisher.
alternativt udførte lo. (1990) kromatografisk trin ved hjælp af præparativ HPLC under anvendelse af en aminosøjle. Hjernens phospholipider blev opløst i 5 ml opløsningsmiddel A og blev påført med en strømningshastighed på 2.,5 ml/min til 10 mm x 250 mm amino-NP-kolonne (5 μm, i sfærisk silica med n-propylamin binded fase, IBM Instrumenter, Danbury, CT) med en 4,5 mm × 50 mm vagt kolonne bringes i ligevægt med Opløsningsmiddel A. kolonne elueres ved et flow på 2,5 ml/min med 25 ml af En Solvent, en 125 ml gradient af 100% Opløsningsmiddel A til 100% i Opløsningsmiddel B, og 100 ml 100% Opløsningsmiddel B; 5 ml fraktioner, der indsamles. De poolede fraktioner koncentreres ved at justere til 18 ml med opløsningsmiddel A og phospholipiderne ekstraheres. Den gennemsnitlige genvinding af organisk fosfor er 80%., En fuldstændig adskillelse af Ptdiner (90 ml), ptdinsp (150 ml) og ptdinsp2 (160-200 ml) blev opnået (kromatogram ikke vist). PtdIns overlapper imidlertid med ptdser. Sammensætningen af toppene blev bestemt med TLC af poolede fraktioner.
lav (1990) har også beskrevet en HPLC-oprensning af de mærkede ptdiner(4)p og ptdiner(4,5)P2 fra humane blodplader. Lipidekstraktet fra blodplader blev fremstillet ud fra 60 ml frisk humant blod i nærvær af methanol udfældede bovine hjerne PtdInsPs som bærer, omdannes til sidst i 0.,5 1 Opløsningsmiddel A og anvendes ved en flowhastighed på 1 ml/min til en 4,5 mm × 250 mm amino-NP kolonne afbalancerede i Opløsningsmiddel A. kolonne elueres med 5 ml af En Solvent (25 ml lineær gradient fra 100% Opløsningsmiddel A til 100% i Opløsningsmiddel B), og 20 ml af Opløsningsmiddel B. En milliliter fraktioner, der indsamles og radioaktivitet med væskescintillationstælling. Den gennemsnitlige genvinding af anvendt radioaktivitet er ca. 70%. Der er en fremragende opløsning af de tre inositolphosphatider, men Ptdinerne overlapper med ptdoh., Derfor er denne HPLC-procedure ikke egnet til fremstilling af ptdiner, da PtdOH, som i de fleste celletyper hurtigere er mærket med Pi, ikke løses fra den. Det er sandsynligt, at andre anioniske phospholipider, såsom ptdser, vil blive dårligt opløst fra Ptdiner ved amino-NP-kolonnen, som observeret med DEAE-cellulose-proceduren.
som beskrevet ovenfor er ingen af ovennævnte metoder effektive til at adskille de individuelle ptdinsp ‘ er i ren form fra råvævsekstrakter. Derfor skal lipidekstrakterne behandles ved flere kromatografiske trin., Til dette formål underkastes ekstraktet først Sephade .chromatografi til adskillelse af lipiderne fra nonlipiderne i ekstraktet. Lipidfraktionen hældes derefter på en DEAE-søjle, der elueres med forskellige opløsningsmidler. Ptdinsp ‘ erne udvindes ved eluering med chloroform/methanol/ammoniumsalt som det endelige elueringstrin. De enkelte fraktioner koncentreres til 100ll ved 45.C under nitrogen, og derefter separeres den koncentrerede rest yderligere ved hjælp af patron-søjlekromatografi, TLC, HPLC eller andre kromatografiske procedurer.,
Singh (1992) har beskrevet ekstraktion og analyse af PtdIns, PtdIns(4)P og PtdIns(4,5)P2 ved hjælp af en Sep-Pak patron. Et totalt lipidekstrakt (Folch et al., 1957) af rottehjernesynaptosomer og mikrofartøjer blev først fremstillet, og den første fraktion genereret (fraktion 1) blev opsamlet og yderligere ekstraheret til at adskille phospholipider og glycolipider som beskrevet af Dugan et al. (1986). Phospholipidfraktionen blev underkastet DEAE-cellulosekromatografi (separationssekvens 4) som beskrevet af Rouser et al. (1969) for yderligere at rense inositollipiderne., Det rensede ekstrakt blev overført til en SEP-Pak-patron. Forskellige inositollipider elueres fra søjlen med en lineær gradient af ammoniumacetat og vand fra 0,5% ammoniumacetat (200 mM) og 99,5% vand til 75% ammoniumacetat og 25% vand i 60 minutter ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min (se Kapitel 2). Søjleeluatet i 120 minutter blev opsamlet i 1 ml fraktioner. Forskellige toppe blev identificeret ved at anvende ptdiner, ptdiner(4)p og Ptdiner (4,5)P2 toppe som referencepunkter., Fraktionerne indeholdende individuelle inositollipider blev poolet og analyseret ved HPLC som beskrevet af Geurts van Kessel et al. (1977). Individuelle fosfolipider blev påvist ved 206 nm ved hjælp af en diodearraydetektor programmeret til at scanne et 200-350 nm område. Singh (1992) har vist 50-90% genopretning af ptdiner og InsPs fra hjerneprøver. InsP3 og InsP4 udviste det laveste opsving på grund af dårlig kvantificering snarere end en dårlig ekstraktionsmetode. Patronmetoderne er ikke anvendt til isolering af PtdIns(3)p, PtdIns(3,4)P2 og ptdins (3,4,5)P3.
Cronholm et al., (1992) har beskrevet isoleringen af ptdinsps fra rottepancreas. Hver bugspytkirtlen straks blev homogeniseret i 3 ml chloroform/methanol (1:2, v/v), og om 3 MBq af 3H-mærket PtdIns(4)P eller PtdIns(4,5)P2 blev lagt sammen med 0,6 ml 1.2 aq. HCl før ekstraktion med chloroform, som beskrevet af Schacht (1981). Methanol blev tilsat til de poolede og vaskede ekstrakter for at give chloroform/methanol (3:2, v / v). Opløsningen blev påført lipide. – DEAE-søjlen, og de fleste af lipiderne blev elueret med chloroform/methanol (3:2, v/v) eller chloroform/methanol/vand (3:6:1 af vol.)., Ptdiner og ptdser blev elueret sammen med 0,03 M H3PO4 og uidentificeret materiale med 0,1 M H3PO4. Ptdiner (4)p blev elueret med 0,25 M H3PO4 og ptdiner(4,5) P2 med 0,5 M H3PO4 som angivet ved den eluerede radioaktivitet. Alle fraktioner blev ekstraheret med 0, 4 ml vand / ml eluat. Den øvre fase blev tilbage-ekstraheret med 0,1 vol. af chloroform. De samlede chloroformfaser blev vasket med 0,4 vol. 0, 5 M HCl i 50% a.. methanol. Fraktionerne blev anvendt til bestemmelse af molekylære arter af FAB / MS (se nedenfor).Gunnarsson et al., (1997) anvendte normal fase HPLC med fordampningsspredningsdetektion til analyse af kommercielle prøver af ptdinsps sammen med andre phospholipider. Under anvendelse af en lineær gradient af A, chloroform / methanol / ammoniak (50: 45:3, af vol.) og B, chloroform / methanol / vand / ammoniak (25: 55:17: 3, vol.) godt løst sent nye toppe for PtdIns(4)p og Ptdins(4,5)P2 opnås. Dosisresponskurverne for Ptdiner (4)p og Ptdiner(4,5) P2 var ikke lineære, hvilket er karakteristisk for lysspredningsdetektoren (resultater ikke vist)., Til de fleste formål er HPLC-teknikken overlegen i opløsning, hastighed og generel bekvemmelighed i forhold til DEAE-cellulose-proceduren og er den valgte metode, hvis HPLC-udstyr er tilgængeligt. DEAE-cellulose er billig, og rensning i stor skala kan kræve brug af dette materiale. HPLC-proceduren er også bedre end nogle eller i alle henseender end alternative procedurer for oprensning af polyphosphosinositider, f.eks. præparativ TLC eller neomycinaffinitetskromatografi.