Telomere struktur — Funktion forhold
Som tidligere nævnt, i mangel af telomerase, telomerer blive ikke-funktionelle, forkorte med på hinanden følgende celledelinger, og kromosom termini, kan fusionere som følge af de-beskyttelse. Telomerfusioner er resultatet af ikke-homolog-end-sammenføjning (NHEJ), som er en af de fremherskende mekanismer for en dobbeltstrengbrud (DSB) – heling., Resultatet af sådanne begivenheder kunne være oprettelsen af kromosomer med mere end én centromeres, som sandsynligvis vil blive samlet til modsatte poler under mitosen, hvilket resulterer i kromosombrud og yderligere genomisk ustabilitet gennem gentagne fusion – brud begivenheder. Hos hvirveldyr tilskrives rollen som kromosomendebeskyttelse for at skelne fra kromosombrud et specifikt kompleks af proteiner, der samlet kaldes shelterin. Shelterin comple.er grundlæggende sammensat af seks proteiner., To medlemmer af shelterin komplekse, TRF1 og TRF2 (fra Telomere Repeat-bindende Faktor 1 og 2) binde sig direkte til dobbelt strandede telomeric sekvens, mens POT1 binder ssDNA. TRF2 interagerer med og rekrutterer RAP1, mens TIN2 formidler TPP1 – POT1 bindende til TIRF1 / TIRF2 centrale kompleks. POT1 binder til og beskytter det 3 enkeltstrengede DNA-overhæng af telomerer (G-hale), mens TIN2 sandsynligvis forbinder de enkelt-og dobbeltstrengede DNA-bindingskomplekser, især inden for den telomere D-loop-dannelse (figur 3) ., Det ser ud til, at denne kerne shelterin kompleks er fortrinsvis placeret i telomer ende (også benævnt telosome), og der serveres både i stabiliserende t-loop struktur, som beskytter den samtidig mod at blive anerkendt som DNA-beskadigelse og repareres af NHEJ. Derudover regulerer shelterin adgangen til restaureringsprocesser af telomerisk DNA efter hver genomreplikation., Generelt, shelterin komplekse synes at fungere som en platform, der regulerer ansættelsen af en voksende liste af faktorer, der er involveret i kromatin remodellering, DNA-replikation, DNA-skader, reparation, rekombination og telomerase funktion, således at regulering telomere adgang / ændring af forskellige cellulære processer (figur 4), der for nylig revideret .
Figur 3.
skematisk model af potentiel telomere capping arrangement af shelterin kompleks., Proteiner fra shelterin-komplekset deltager i telomerbeskyttelse, replikation og længderegulering. Trf1 og TRF2 proteiner binder specifikt til telomer ds DNA, mens POT1 (TPP1) genkender ssdna (stabiliserende D-loop). TIN2 forbinder ssDNA til dsDNA bindende komplekser, stabiliserende telosom struktur. Telomere DNA består af gentagne DNA sekvens, en duple.region og en Ssdna G-streng overhæng (G-streng, orange, C-streng, blå). Shelterin-komplekset binder til både duple.–og ssDNA-regionerne gennem specifikke protein-DNA-interaktioner., Dannelse af t-loop involverer streng invasion af G-overhæng til at skabe en forskydning-loop (D-loop). T-sløjfen foreslås at maskere kromosomenden fra DNA-skadesensorer. Af enkle grunde er shelterin-komplekset afbildet som et seks-proteinkompleks homogent dispergeret på telomer. Se tekst for yderligere detaljer.
interessant nok ser det ud til, at mere end en type core shelterin-kompleks eksisterer, og ikke alle er nødvendigvis en del af telosomet. Komplekser, der kun indeholder TRF1-TIN2-TPP1-POT1 eller TRF2-RAP1 er blevet opdaget., De seneste data måle den absolutte og relative mængder af TRF1 og TRF2 i den celle, der viste, at TRF2 er omkring dobbelt så rigelige, som TRF1 og dette er i overensstemmelse med TRF2 at blive opdaget i rumligt rettet DNA-skader fremkaldt foci i ikke-telomeric kromosomområder. Trf2-rekruttering til steder med DNA-skade er i overensstemmelse med, at det spiller en kritisk rolle i DNA-skaderesponsen . Kompleksiteten af det telosomoprettede netværk er praktisk taget baseret på de unikke strukturelle egenskaber hos shelterin-medlemmerne., TRF1 og 2 bærer et SAB / MYB-domæne, hvorved de begge genkender et ttagggt-motiv på telomer DS-DNA, et surt rig (D/E) terminalområde og et specifikt dockingsmotiv kaldet TRF homology (TRFH) motiv . TRFH-domænet formidler homo-dimerisering af TRF1 eller TRF2, men forbyder heterodimerisering på grund af strukturelle begrænsninger . Der kræves et f .l .p-motiv og et Y/F .l .p-motiv til henholdsvis trf1 og TRF2-binding. Disse domæner kaldes Trfh-Bindingsmotiver (TBM). Phe 142-aminosyreresten i TRF1-TRFH-motivet er ansvarlig for TIN2-binding gennem dets tbm-region., TIN2-TBM har væsentligt lavere affinitet til den tilsvarende region i TRF2 (Phe 120) på grund af strukturelle forskelle i nærheden af Phe 120 og endelig er knyttet til TRF2 via en unik TRF2-regionen, nær den N-terminus af protein. Ikke desto mindre er Phe 120-rest afgørende for specifik interaktion med andre telomere-associerede faktorer som Apollo nuclease, en trf2-bindingspartner. Kompleks dannelse mellem shelterin-kernemedlemmer og tilknyttede faktorer med TBM-lignende motiver vil sandsynligvis også blive styret af ændringer i bindende affiniteter på grund af post-translationelle ændringer., Et godt eksempel er den TRF1 parsylation af tankyrase, hvilket resulterer i en betydelig nedgang af DNA-TRF1 affinitet, så telomere forlængelse og søster telomerer adskillelse ved specifikt at lindre samhørighed kompleks fra TRF1 og TIN2 . Misbalance af sådanne interaktioner kan være skadelig for genomintegriteten som vist ved forhøjede niveauer af TIFS dannet i celler, der overudtrykker en isoleret tbm som en tandem YRL-gentagelse. Analoge skadelige resultater blev opnået ved ekspression af en trf2-F120 substitutions allel .,
de Seneste strukturelle studier af en af de to OB (Oligonukleotid/oligosaccharide-bindende) folder S. pombe Pot1, der udgør den bindende site af ssDNA, viste, at non-specifikke nukleotider anerkendelse af ssDNA er opnået en hidtil ukendt bindende tilstande, der termodynamisk kompensere for base-udskiftninger gennem alternative stabling samspil og nye H-bonding) netværk . Dermed, afgrænse i detaljer strukturen af shelterin medlemmer og tilhørende faktorer forventes at Geometrisk forbedre vores forståelse af de netværk bestod og den måde mængde vs., kvalitetsændringer forstyrrer strukturelle ændringer, der fører til funktionelle ændringer, finjustering af genomstabilitet. Uden tvivl har det væld af indsamlede oplysninger allerede banet vejen for anvendelse af anti-telomerase-midler i kliniske forsøg med robust forventet resultat.
bortset fra shelterin og interagerende partnere har et andet vigtigt kompleks for nylig vist sig også at være involveret i telomerbiologi, CST-komplekset. CST-komplekset er sammensat af CTC1, STN1 (OBFC1) og TEN1, og er blevet tilskrevet redning af stå replikation gafler under replikation stress., CST-komplekset forbinder telomerer til genomreplikation og beskyttelse uafhængigt af Pot1-vejen .
Akkumulere dokumentation af en lang række publikationer ganske uventet vist, at DNA-skade respons (DDR) og reparation af veje, på trods af tilsyneladende et paradoks, deler fælles træk med telomere vedligeholdelse strategier. DDR tidlige responsproteiner rekrutteres til telomerer, og proteiner, der antages at fungere i telomervedligeholdelse, har også vist sig at være involveret i DDR., Paradoksalt nok ser DDR-faktorer i telomerer under normale forhold ud til at forstyrre telomere-restaurering og længdeopbevaring. Dette distinkt fænomen tilskrives shelterin koordinering af DDR faktorer, adgang og funktion på telomerer. TRF2 kan binde til og undertrykke ATM, mens POT1, når den bindes til G-halen gennem TPP1, hæmmer ATR. Undertrykkelse af trf2-aktivitet fremkalder p53 og ATM-aktivering, hvilket fører til telomer dysfunktion induceret foci (TIFs). TIFs resulterer i ende-til-ende telomerfusioner via NHEJ-vejen, og deres udseende er korreleret med induktion af senescens ., Samspillet synes at være baseret på shelterin mængde og telomerlængde, to parametre, der er direkte relateret til hinanden, som når telomerer er kritisk kort, de er mindre tilbøjelige til at danne et t-loop, en reaktion catalysed af TRF2 in vitro, og til gengæld mindre shelterin er bundet på . Derfor reduceres to store telomervedligeholdelsesstrukturer betydeligt (t-loop og shelterin-belægning), hvilket tillader DDR-aktivering., Endnu, er ganske betagende, NHEJ maskiner også kan udøve en beskyttende rolle på telomerer gennem den enzymatiske aktivitet af Tankyrase relateret til fremme af DNA-PKcs stabilitet og forebyggelse af dannelsen af telomere sister chromatid udvekslinger (T-Sce-selskaber), som et produkt af inter-telomere rekombination
en Anden spændende paradigme er MRN-komplekset (et protein kompleks af meiotisk rekombination 11 (MRE11) – RAD50 og NBS1 protein), hvor en enkelt NBS1 molekyle, som er forbundet med to-dimerer af MRE11 og RAD50 ., Mre11-og RAD50-proteinerne danner en heterotetramer, der indeholder to DNA-bindende og forarbejdende domæner, der kan bygge bro over frie DNA-ender . MRN-komplekset lokaliseres til telomerer i S – og G2-faserne i cellecyklussen gennem direkte interaktion mellem NBS1 og TRF2, hvilket formodentlig bidrager til dannelsen af G-hale på den førende telomerstreng og dermed til telomerstabilitet ., I mennesker, mutation i den NBS1 genet fører til kromosomale ustabilitet, lidelse, Nijmegen brud syndrom 1, er associeret med øget følsomhed for ioniserende stråling og kromosomal instabilitet og tidlig udvikling af kræft, selv i NBS1+/- heterozygotes. NBS1 indeholder et forkhead-associeret (FHA), et BRCT (BRCA1 C Terminus) domæne, et mre11-bindende domæne og et ATM-interagerende domæne. Akkumulerende bevis viser, at NBS1 interagerer med telomerer og bidrager til deres stabilitet, i det mindste i humane og museceller., Indirekte immunfluorescensforsøg afslørede , at NBS1 co-lokaliserer med TRF2 I S – fasen i dyrkede HeLa-celler, muligvis ved at modulere t-loop-dannelse. Da TRF2 også er fundet på ikke-telomere sekvenser, kræver virkningen af nbs1-samlokalisering med TRF2 yderligere afklaring. Tilsvarende er der i musembryonale fibroblaster observeret aktiv rekruttering af NBS1 til dysfunktionelle telomerer . MRN-komplekset ser ud til at spille en dobbelt rolle i telomerbiologi. Den ene er at mægle, i det mindste delvist, ATM-responsen, der fører til TIF-dannelse efter TRF2-sletning ., For det andet er det ved sin nuklease-aktivitet nødvendigt for normal telomerdannelse, da MRN er impliceret i behandlingen af beskadigede telomerer ved at påvirke produktionen af overhænget fra en stump endetelomere oprettet efter telomerreplikation . En sådan acceleration af G-hale dannelse, følgende telomere dysfunktion / de-beskyttelse forhindrer sammensmeltning af førende stump-endte dele af de beskyttede telomerer i løbet af S-fase. Apollo nuclease kan også rekrutteres og være involveret i denne proces., Direkte interaktion af NBS1 med telomere repeat-bindende faktor 1 (TRF1) har vist sig for udødeliggjort telomerase negative celler, hvilket betyder, at denne interaktion kan være involveret i den alternative forlængelse af telomerer. Desuden, i telomerase, der udtrykker celler, MRN komplekse, gennem nedregulering og fjernelse af TRF1 (NBS1-afhængige fosforylering af TRF1 af ATM) kan også fremme tilgængeligheden af telomerase til 3 ende af telomerer ., Reparation af DNA, forbindelsestrapper med telomere stabilitet er et forhold, der er etableret meget tidligt i evolutionen, som indikeret af det faktum, at MRE11 og RAD50 sammen med protein kinaser HÆVEAUTOMAT og ATR, er også afgørende for korrekt telomere vedligeholdelse i planter .
Figur 4.
Shelterin-associerede faktorer er også involveret i DNA-Skaderespons., Detaljer i tekst
for Nylig, et andet protein phosphatase, PNUTS (fosfatase 1 nuklear-målretning mod enhed), som interagerer med TRF2, indsætter endnu en brik i det puslespil af DDR og telomere forhold . Derudover detekteres ved genom-bred søgning efter TBM-indeholdende proteiner, interagerer de tre BRCT-domænebærende MCPH1 proksimal DDR-faktor også med TRF2. MCPH1-mutationer er forbundet med udviklingsfejl og øget tumorincidens ., MCPH1 udarmede celler præsenterer nedsatte niveauer af BRCA1 og Chk1 og er defekte i G2 / M kontrolpunktet .
en væsentlig rolle i telomerintegritet tilskrives også BRCA2, en nøglekomponent i HR-DNA-reparationsvejen. BRCA2 associerer med telomerer i s / G2-cellecyklusfaserne og ser ud til at lette RAD51 rekombinaseindlæsning . Derfor kræves BRCA2-medieret HR-aktivitet til vedligeholdelse af telomerlængde. Disse fund kan i det mindste delvist forklare de kortere telomerer, der findes i BRCA2-muterede humane brysttumorer., Derfor kan telomerdysfunktion også være impliceret i den genomiske ustabilitet, der observeres i BRCA2-mangelfulde bryst-og æggestokkræft .
i alt er der fundet et antal DNA-reparationsmolekyler, som samlet er en del af HR -, NHEJ -, NER-og Fanconi-anæmi-veje rekrutteret i telomerer, hvor TRF2 hovedsageligt fungerer som et proteinnav., Under normale forhold er Atm / ATR-signalering efter de-beskyttelse på grund af kort telomerlængde og efterfølgende ‘pensionering’ af cellen (senescens / apoptose) en del af den normale, tumorinitieringsbeskyttelsesmekanisme mod genom-destabiliserede celler. I celler, der bærer normal telomerlængde, er der hæmmende forhold mellem disse forskellige DNA-reparationssystemer, hvilket forhindrer hinandens aktivering.
telomerer er en del af heterochromatinstruktur, hvilket betyder, at specifikke signaler definerer deres placering i kernen., Selvom det faktum, at telomerer forventes at være per definition stabile og inerte kromosomender, ser det ikke desto mindre ud til at være dynamiske nukleoproteinkomplekser, der også er involveret i kromatinomdannelse. Rekruttering af heterochromatin bindende protein, HP1 , beriget tri-methylering af histon H3 lysin 9 (H3K9) og H4K20 , samt methylering af CpG dinucleotides i subtelomeric DNA gentager understøtte denne opfattelse. Disse heterokromatiske mærker erstattes af egenskaber ved åben kromatin (øget acetylering på histonhaler osv.) når telomerer bliver kortere., Sådanne ændringer indebærer, at der kræves en minimum telomerlængde for at opretholde heterochromatinlignende konformation ved kromosomender, en struktur, der kan ændre sig efter telomere–slid. Desuden bør telomerer og shelterin-komplekset løsne deres stramme struktur under kromosomreplikation og genoprette deres kompakte form efter afslutning af DNA-duplikering. En analog løsning af telomerstruktur bør kræves i tilfælde af telomere-restaurering ved enten telomerase-eller DNA-reparationsmekanismer, skønt muligvis gennem forskellige procedurer., For at opnå denne plasticitet bør kromatin ombygges gennem et antal en .ymer i henhold til en lokal histonkode . En række histon modifikationer er impliceret, hvor forskellige histon hale-protein interaktioner fremme telomer kompleks struktur afslapning eller kompression . Som et eksempel, SIRT6 (en histon H3K9 deacetylase, der modulerer telomeric kromatin) udtømning forsøg med RNA interferens fremlagt bevis for, at øget nukleare DNA-skader og dannelse af telomere dysfunktion-induceret foci., Disse eksperimenter antydede, at SIRT6 beskytter endotelceller mod telomer og genomisk DNA-skade, hvilket forhindrer et fald i replikativ kapacitet og begyndelsen af for tidlig senescens, i dette særlige tilfælde involveret i at opretholde endotelhomeostatiske funktioner og forsinke vaskulær aldring.
et andet vigtigt sæt faktorer, der implicerer i telomerbiologi, er produkterne af ATR. – og da.. – gener, som er impliceret i kromatinomdannelse sammen med histon H3. 3., Mutationer eller sletninger i disse genetiske loci er direkte korreleret med ALT+ – status på cellelinjer eller tumorer i sig selv . I henhold til disse fund kan screening for ATR./da.. – mutationer/ekspression repræsentere den mest opdaterede pålidelige markør for tumorer, der har valgt ALT TMM – vejen.,
Kollektivt, det er korrekt samling af shelterins i telomerer, som er afgørende for kromosom stabilitet (adskiller kromosom-enderne fra DNA-ds bryder og forhindrer tab af genetisk information, enten gennem nucleolytic angreb (exonuclease-medieret nedbrydning) eller afvigende kromosom fusioner og uønskede rekombination, i løbet af en celles levetid., Sammen med korrekt struktur reguleres funktionel koordinering, der styrer TMM og telomeraseaktivitet, strengt gennem hele cellecyklussen af en række implicerede tilbehørsfaktorer, der transient rekrutteres af shelterin-komplekserne / subkomplekserne .
bortset fra deres beskyttende rolle tillader korrekt interaktion af shelteriner med komponenter i DNA-reparationsmaskiner samt telomerasekomponenter og telomerase rekruttering telomer restaurering, når det er relevant., Vigtigheden af korrekt struktur – funktion af shelterin komponenter i telomer biologi og kræft dannelse, sammen med telomer-associerede sygdomme, er afbildet ved sammenslutning af mutation detection i dvs TIN2 i mange af disse tilfælde .