introduktion
Ambergris, et kendt naturprodukt af kaskelothvalen , findes også som jetsam på strande over hele verden og har været meget værdsat for dets anvendelighed i parfumeindustrien . Selvom det længe har været fastslået , at jetsam ambergris indsamlet på strande stammer fra kaskelothvaler, lidt eller intet bevis for dette er nogensinde blevet offentliggjort, og der findes sondringer mellem sådanne prøver og prøver af ambergris direkte taget fra kaskelothvaler., For eksempel, strandingsgods ambra prøver generelt indeholder meget højere andele af triterpenoid alkohol ambrein og meget lavere andele af steroler, som end ikke prøver af ambra fra kaskelothvaler . Omvendt dog, jetsam ambergris undertiden indeholder fragmenter af blæksprutte næb, og da blæksprutter, såsom blæksprutter, udgør den største diætbestanddel af kaskelothvaler, dette er blevet nævnt som bevis for en Oprindelse af jetsam coproliths fra kaskelothvaler. Det er endda teoretiseret ambergris kan stamme som en patologisk sekretion fra irriterende af den hårde blæksprutte næb chitin ., Andre arter af havpattedyr (f .eks. medlemmer af Globicephala ogiphiphiidae) foregår dog også på blæksprutter , og nogle (herunder dværg-og pygmæ-kaskelothvaler) nævnes også som potentielle kilder til ambergris. Derfor, for yderligere at belyse oprindelsen af strandingsgods ambra, har vi analyseret DNA fra en ambra prøve indsamlet fra en kaskelot strandet i Holland, og sammenlignet det med DNA-sekvenser, der er isoleret fra strandingsgods ambra, der er indsamlet fra strande i New Zealand og Sri Lanka.,
Ambergris anses for at være overvejende sammensat af ambrein på grund af dets produktion fra S .ualen, et almindeligt metabolisk produkt i mange organismer . Denne proces kan induceres af tarm mikrobiel indflydelse, og udfældes i tætte, faste masser i hvalen kolon . De coprolitiske accretioner, der resulterer, er sammensætningsmæssigt velegnede til at bevare DNA fra tyktarmen, da ambrein er hydrofob og tilsyneladende resistent over for nedbrydning i det sure enteriske miljø., Bevis fra radiocarbon dating indikerer bestemt modstand mod mikrobiel og fotoredbrydning i havmiljøet i op til et årtusinde i nogle jetsam ambergrisprøver . Vi antog, at sådant materiale kunne give et passende cache til konservering af DNA, selv efter langvarig udsættelse for skadelige forhold til søs.
materiale og metoder
Jetsam ambergris prøver fra Nordsøen, Det Indiske Ocean og Stillehavet blev analyseret, repræsenterer materialets globale distribution ., Tre jetsam ambergris-prøver (en fra Sri Lanka, to fra Pitt Island, NE..ealand) blev undersamplet til DNA-ekstraktion. En fjerde prøve stammer fra dissektion af en mandlig kaskelothval strandede i December 2012, ved RA .ende Bol nær te .el, Holland. Sidstnævnte ‘friske’ ambergris, fra en bekræftet sædhvalekroppe, gav en kendt sammenligning med jetsam-prøverne med ubekræftet biologisk historie. Prøver af ambergris blev opnået og analyseret for ambrein og fækalt sterolindhold i tidligere undersøgelser .,
DNA-ekstraktion og sekventering blev foretaget på GLOBE Institute, Københavns Universitet, i et dedikeret gammelt DNA-laboratorium efter strenge procedurer for minimering af forurening. 120 mg blev subsamplet (figur 1 og tabel 1) til DNA-ekstraktion. Prøver blev inkuberet i 400 µl proteinase K-indeholdende buffer efter Gilbert et al. ved 56 C C i 10 timer; supernatanter blev derefter behandlet under anvendelse af et phenol–chloroformtrin efter Carøe et al., og renset ved hjælp af Monarch DNA oprydning kolonner (5 µg) (ne.England Biolabs, Beverly, MA, USA) i henhold til producentens retningslinjer. Dobbeltstrengede biblioteker blev bygget fra DNA-ekstrakter efter den bedste protokol, designet og bevist specifikt til sekventering af gammelt og nedbrudt DNA. Biblioteker blev forstærket og indekseret gennem PCR ved hjælp af PfuTurbo C.Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) i henhold til producentens retningslinjer., Produkter blev samlet i ækvimolære koncentration før sekventering på en Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, amerikas forenede stater) – platform, der bruger 80 bp enkelt ende læse kemi på det danske High-throughput DNA-Sekventering Center, København, Danmark.
Figur 1. Detaljer for ambergris prøver analyseret. a) kort, der viser lokaliteter, hvor ambergrisprøver oprindeligt blev fundet., (b) Billeder, der viser høj diversitet i fysiske egenskaber af ambra fragmenter: TEXEL151212 (fra dissekeret hval prøven) blev grynet i konsistensen, mens jetsam prøver overfladisk syntes mere tætte og heterogene, og var internt equigranular og betydeligt lysere i farven.
| prøve | sted | den samlede masse (g) | analyseret masse (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Ø, New Zealand | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | west Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Holland | 83000 | 92 | 93 |
| prøve | i alt overført læser | gennemsnitlige bevaret læs længde (bp) | i alt justeret læser (mtDNA) | gange for dækning (mtDNA) | i alt justeret læser (hele genomet) | gange for dækning (hele genomet) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | er 71,7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
Sekvens analyse blev foretaget på high-performance computing facilitet, på Københavns Universitet, med FASTQ filer forarbejdet ved hjælp af de PALEOMIX pipeline (v. 1.2.13) . Fast v.c v. 0.11.8 blev oprindeligt brugt til kvalitetskontrol af rå sekvensdata. Adaptere blev trimmet ved hjælp af AdapterRemoval v. 2.3.1, med læser mindre end 25 bp også fjernet. Læsninger blev derefter kortlagt til referencesekvenser ved hjælp af B .a , også anvendelse af mapDamage2.,0 til grundlæggende nedbrydning kvantificering, producerer alignments med referencer sekvenser. ANGSD blev derefter brugt til at producere sekvenser i FASTA format.
usikkerhed omkring oprindelsen og de biologiske mekanismer til fremstilling af ambergris fik os til at overveje flere mulige kandidathvaler og pinnipede arter i sekvensanalyse. Artsidentitet blev udledt ved at kortlægge succes og fylogenetisk forhold til 19 cetacean og pinniped kandidatarter i NCBI Refse. (se det elektroniske supplerende materiale)., Disse arter blev valgt ud fra potentiel egnethed som dybdykkende havpattedyr, der fylder en lignende økologisk niche som sædhvaler, for at udelukke, at sådanne arter er tilpasset til at producere ambergris. Prøvesekvenser blev sammenkædet og justeret ved hjælp af MAFFT v. 7.392 . Fylogenetiske træmodeller blev derefter produceret i MEGA.ved hjælp af metoden med maksimal sandsynlighed med Hasega .a-Kishino–Yano–modellen , med afstande estimeret ved den maksimale sammensatte sandsynlighedsmetode (detaljer om alle anvendte referencesekvenser er inkluderet i det elektroniske supplerende materiale).,
Resultater
Den fylogenetiske analyser, der utvetydigt støttede kaskelot oprindelse af de fire ambra prøver (figur 2; elektronisk supplerende materiale, figur S1). Ligeledes producerede justering med Physeter macrocephalus mitokondrielle referencegenom fra NCBI (NC_002503.2) de højeste dækningsresultater for alle prøver af alle de foretagne justeringer og giver en selvsikker tilskrivning, dog med betydelige variationer i succes mellem prøver. Sekventering af prøven fra en strandet kaskelothval (te .el151212) produceret langt den højeste dækning (ca., 20×) for kaskelothval mitokondrion, mens en af jetsam prøverne fra Pitt Island (S. 01) kun gav ca 0,2 coverage dækning (se tabel 2). Linjeføringer med Kogia sima (dværg kaskelot) og Kogia breviceps (pygmæ kaskelot) reference mitokondrie-genomer (NC_041303.1, NC_005272.1) også viste dækning (nærmere oplysninger i elektronisk supplerende materiale), men der er mange meget velbevarede funktionelle regioner er delt mellem de analyserede arter, der resulterer i høj sekvens lighed . Imidlertid var dækningen for kogiid-arter typisk omkring en faktor på 10 mindre end for Physeter., Tilpasning til P. macrocephalus hele nukleare reference genom (asm283717v2) var også vellykket, selv om dette er mere tydeligt i sammenligninger af det samlede antal læsninger kortlagt til genomet. Alignment for Architeuthis du. (giant s squiduid), en ansete fælles bytte af kaskelothvaler (f,), var forgæves, men dette er ikke deres fremherskende bytte.
Figur 2. Maksimal sandsynlighed fylogenetisk træ model genereret fra reference sekvenser og justeret prøve mitokondrie genomer., Prøverne er klart beliggende som gruppering med kaskelothval (P. macrocephalus) snarere end dværg og pygmæ kaskelothvaler (Kogia spp.). Dette træ afspejler den højeste log-sandsynlighedsmodel, værdier afspejler procentdelen af træer beregnet, hvor de tilknyttede ta .aer blev samlet, hvilket indikerer tillid til positionering, og grenlængder måler antallet af substitutioner på hvert sted (se skala). Figur produceret i MEGA.. Hval skildringer fra: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whhales_si .e.svg., En fylogenetisk træ, herunder alle 19 kandidat arter er præsenteret i elektronisk supplerende materiale, figur S1.
Resultaterne fra MapDamage vis bemærkelsesværdigt lidt inter-sample “- version, der påvirker C til T overgange på 5′ strand ender, dog med en højere procentdel af G til En overgange i 3′ enden eksisterer for S. 01 (nærmere oplysninger i elektronisk supplerende materiale, figur S2), angiver mulige højere biomolekylær nedbrydning., I almindelighed er der imidlertid kun forekommet meget lidt kemisk modifikation, og fordelingen af forandringer paa Strengene forbliver ensartet og flad.
Diskussion
denne undersøgelse har vist, at tre jetsam ambergris-prøver med sikkerhed kan tilskrives sædhval gennem DNA-ekstraktion. Mens bekræftelse af en kaskelot oprindelse for strandingsgods ambra er ikke et overraskende resultat, at den foreliggende undersøgelse er den første i at yde en betydelig proof-of-concept i at hente endogent DNA fra ambra og med held brugt det for organismen identifikation., Vigtigere er, at oprindelsen af alle tre jetsam ambra prøver undersøgt, her kan trygt blive identificeret som en kaskelot på grundlag af ikke kun genetisk tilpasning succes, men også modellering af mitokondrie-genomer i fylogenetiske slægtskab træer, herunder for en stor stikprøve af outgroup marine pattedyr taxa., Selvom alle prøver, der blev analyseret her, blev identificeret som stammer fra kaskelothval, er det dog stadig meget muligt, at andre nært beslægtede dybdedykkende havpattedyr (såsom dværg-og pygmæ-kaskelothvaler) kan producere ambergris og simpelthen stadig ikke er blevet registreret som at gøre det til dato.
den dominerende årsag til den dramatiske variation i genetisk dækning, der ses mellem prøver, er uklar. Analyse af DNA-nedbrydning i mapDamage2.,0 viser ringe korrelation med justeringsdækninger, som man kunne forvente, og der er også lidt variation mellem ambreinindhold i prøver, der kan forventes at bidrage til differentiel DNA-konservering. Den nøjagtige alder af de nuværende jetsam-prøver er ukendt, skønt tidligere undersøgelser med succes har radiocarbon dateret andre ambergris-prøver . Imidlertid, radiocarbon dating af relativt nylige prøver er problematisk på grund af virkningen af fossile brændstofemissioner , og radiocarbon-datoer siden stigningen i antropisk kulstoffrigivelse er upålidelige., Produktion af en konsistent nedbrydningshastighed for G Til a-overgange i pålideligt daterede ældre prøver kan, i fremtiden, hjælpe en bedre forståelse af differentiel DNA-skade. En anden mulighed for fremtidig forskning kan være undersøgelser af glutamin deamidation og asparaginsyre racemisering fra analyse af økologisk peptider muligvis også til stede i ambra . Alternativt, imidlertid, intra-prøve variation i DNA og ambrein koncentration kan lige så sandsynligt tegner sig for lav dækning i prøve S.,01, mens nyere eksponering for sædhvalvæv utvivlsomt tegner sig for den høje dækning i strandede hvalprøve te .el151212.
konserveringspotentialet for ambrein udfældes for DNA strækker sig ikke kun til endogen hvalgenetik, men også til metagenomisk dækning af hvalens tarmmikrobiom og potentielt også DNA fra deres bytte. For eksempel kan DNA også forblive inden for delvist eller ufordøjet blæksprutte næb , der findes i sædhvalens fæces , og i ambergris, som endda teoretiseres for at være en patologisk årsag til ambergris-sekretion ., Forståelse af prokaryote sammensætning af microbiome miljø i ambra også kunne yderligere belyse oprindelsen af ambra, især i omstillingen af squalen at ambrein og den proces, som ambra synes at danne sig i lag på tilvækst. Yderligere analyser af endogen DNA-hentning fra jetsam ambergris, inklusive også DNA fra hvalgut mikrobiota og bytte, ville give markant større indsigt i sædhvaløkologi, evolution og stofskifte.,
konklusion
Jetsam ambergris har længe været et gådefuldt materiale, der er genstand for diskussion og analyser i videnskabelige publikationer siden det attende århundrede . Denne undersøgelse er den første til vores viden til at præsentere endelig bekræftelse af den biologiske Oprindelse af jetsam ambergris-prøver som sædhvaler gennem DNA-analyse. Ud over dette, imidlertid, den nuværende undersøgelse udstikker potentialet i ambergris som en ny kilde til genetiske data relateret til kaskelothvaler med en betydelig levetid over tid., Større afklaring skal stadig opnås gennem undersøgelsen af konserveringsbetingelserne for DNA i ambrein og af de forskellige virkninger fra flere faktorer. Imidlertid, de potentielle konsekvenser for at hjælpe vores forståelse af tidligere befolkningsdynamik hos hvaler og deres økologisk tilknyttede ta .a kan være dybe. De ældste kendte ambergris, der findes inden for Pleistocenaflejringer, har permineraliserede blækspruttebæger, der indeholder aminosyrer endogene til blæksprutte, som forfatterne tilskriver konserveringskapaciteten i det lokale sediment ., Selvom det er usandsynligt, at DNA vil blive bevaret i en sådan alder (1, 75 Ma), kan dette fund også tilskrives effektiviteten af Ambra og ambrein som konserveringssubstrater. Meget er stadig ukendt om økologien og tilpasningen af de marine giganter, der tidligere var karakteriseret som semi-mytiske dyr, og ambergris kan nu vise sig at være en lille, men vigtig nøgle til at forstå nogle yderligere aspekter af dem.
etik
alle prøver blev opnået og analyseret etisk i denne undersøgelse, en del af DG-128 PROTEIOS-projektet., Af de fire ambra prøver, der er analyseret i denne undersøgelse, tre (S. 01–S. 03) var subsampled fra materiale, der er undersøgt af S. J. R. i tidligere publikationer (se ovenfor), er fremstillet som strandingsgods ambra, der findes på strande (prøve nr ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 og ACL237-S. 03). Den fjerde prøve (TEXEL151212) var venligst stillet til rådighed som et deludsnit af ambra prøve TEXEL151212 af Dr. A. Oosterbaan på vegne af EcoMare Museum, Texel, Holland, hvor resten af denne prøve er stadig holdt. Vi er taknemmelige for museets tilladelse til at bruge denne prøve.,
Data tilgængelighed
Forfatteres bidrag
Konkurrerende interesser
Vi erklærer, at vi ikke har nogen konkurrerende interesser.
støtte
støtte fra Danmarks Grundforskningsfond grant PROTEIOS (DG128).
anerkendelser
R. M. er Dr. J. A. Samaniego taknemmelig for rådgivning om genomiske analyser, og også til M. McCarthy for rådgivning og diskussioner. Vi er taknemmelige for DR. A. Oosterbaan (Ecomare Museum, te .el) for prøve S. 04 og anonyme samlere for prøve S. 01–S. 03., Forfatterne vil gerne anerkende bistand fra Danmarks nationale high-Throughput sekventering Center i Illumina data generation.
fodnoter
elektronisk supplerende materiale er tilgængeligt online påhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
udgivet af Royal Society under betingelserne i Creative Commons Attribution Licensehttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, som tillader ubegrænset brug, forudsat at den oprindelige forfatter og kilde krediteres.