jorden er hjemsted for millioner af bakteriearter, hver med unikke egenskaber. At identificere disse arter er kritisk i evalueringen af miljøprøver. Læger skal også skelne mellem forskellige bakteriearter for at diagnosticere inficerede patienter.
for at identificere bakterier kan der anvendes en række teknikker, herunder mikroskopisk observation af morfologi eller vækst på et specifikt medie for at observere kolonimorfologi., Genetisk analyse, en anden teknik til identifikation af bakterier er vokset i popularitet i de senere år, delvis på grund af 16S ribosomal RNA-gensekvensering.
det bakterielle ribosom er et protein RNA-kompleks bestående af to underenheder. 30S-underenheden, den mindste af disse to underenheder, indeholder 16S rRNA, som er kodet af 16S rRNA-genet indeholdt i det genomiske DNA. Specifikke regioner i 16S rRNA er stærkt bevarede på grund af deres væsentlige funktion i ribosomsamling. Mens andre regioner, der er mindre kritiske for funktion, kan variere blandt bakteriearter., De variable regioner i 16S rRNA kan tjene som unikke molekylære fingeraftryk for bakteriearter, så vi kan skelne fænotypisk identiske stammer.
efter opnåelse af en kvalitetsprøve af gDNA kan PCR af 16S rRNA-kodningsgenet begynde. PCR er en almindeligt anvendt molekylærbiologisk metode, der består af cyklusser med denaturering af den dobbeltstrengede DNA-skabelon, udglødning af universelle primerpar, som forstærker stærkt konserverede regioner af genet og forlængelsen af primere med DNA-polymerase., Mens nogle primere forstærker det meste af 16S rRNA-kodende gen, forstærker andre kun fragmenter af det. Efter PCR kan produkterne analyseres via agarosegelelektroforese. Hvis amplifikation var vellykket, skal gelen indeholde et enkelt bånd af en forventet størrelse, afhængigt af det anvendte primerpar, op til 1500bp, den omtrentlige længde af 16S rRNA-genet.
efter oprensning og sekventering kan de opnåede sekvenser derefter indtastes i BLAST-databasen, hvor de kan sammenlignes med reference 16S rRNA-sekvenser., Da denne database returnerer kampe baseret på den højeste lighed, dette tillader bekræftelse af identiteten af de bakterier af interesse. I denne video, vil du observere 16S rRNA gen sekventering, herunder PCR, DNA-sekvens analyse og redigering, sekvens samling og database søgning.
Ved håndtering af mikroorganismer er det vigtigt at følge god mikrobiologisk praksis, herunder anvendelse af aseptisk teknik og brug af passende personlige værnemidler. Efter at have foretaget en passende risikovurdering for den pågældende mikroorganisme eller miljøprøve, skal der opnås en prøvekultur., I dette eksempel anvendes en ren kultur af Bacillus subtilis.
for at begynde skal du dyrke din mikroorganisme på et passende medium under de passende forhold. I dette eksempel dyrkes Bacillus subtilis 168 i LB bouillon natten over i en rystende inkubator indstillet til 200 o / min ved 37 grader Celsius. Brug derefter et kommercielt tilgængeligt kit til at isolere genomisk DNA eller gDNA fra 1, 5 ml af B. subtilis natten over Kultur.
for at kontrollere kvaliteten af det isolerede DNA blandes først fem mikroliter af det isolerede gDNA med en mikroliter DNA-gelindlæsningsfarvestof. Læg derefter prøven på en 0.,8% agarosegel, der indeholder DNA-farvningsreagens, såsom SYBR safe eller ETBR. Herefter lægges en en kilobase molekylmasse standard på gelen, og kør elektroforesen, indtil det forreste farvestof er cirka 0, 5 centimeter fra bunden af gelen. Når gelelektroforesen er færdig, visualiser gelen på en blåt lys transilluminator. GDNA skal fremstå som et tykt bånd, over 10 kilobase i størrelse og have minimal udtværing.
herefter skal du mærke tre mikrocentrifugerør som 10,, 100.og 1000. for at skabe serielle fortyndinger af gDNA., Brug derefter en pipette til at dispensere 90 mikroliter sterilt destilleret vand i hvert af rørene. Tilføj derefter 10 mikroliter af gdna-opløsningen til 10. – røret. Pipetter hele volumenet op og ned for at sikre, at opløsningen blandes grundigt. Fjern derefter 10 mikroliter af opløsningen fra 10 tube-røret og overfør dette til 100. – røret. Bland opløsningen som tidligere beskrevet. Til sidst overføres 10 mikroliter af opløsningen i 100 tube-røret til 1000. – røret.
for at starte PCR-protokollen skal du tine de nødvendige reagenser på is. Forbered derefter PCR-mastermi mixen., Da DNA-polymerasen er aktiv ved stuetemperatur, skal reaktionen, der er oprettet, forekomme på is. Aliotuot 49 mikroliter af masterblandingen i hvert af PCR-rørene. Derefter tilsættes en mikroliter skabelon til hvert af forsøgsrørene og en mikroliter sterilt vand til det negative kontrolrør, pipettering op og ned for at blande. Herefter indstilles PCR-maskinen i henhold til det program, der er beskrevet i tabellen. Placer rørene i thermocycler og starte programmet.,
Når programmet er afsluttet, skal du undersøge kvaliteten af dit produkt via agarosegelelektroforese, som tidligere vist. En vellykket reaktion under anvendelse af den beskrevne protokol bør give et enkelt bånd på cirka 1,5 kilobase. I dette eksempel gav prøven indeholdende 100 diluted fortyndet gDNA det højeste kvalitetsprodukt. Rens derefter det bedste PCR-produkt, i dette tilfælde 100 GD gDNA, med et kommercielt tilgængeligt kit. Nu kan PCR-produktet sendes til sekventering.
i dette eksempel sekventeres PCR-produktet ved hjælp af fremadrettede og omvendte primere., Således genereres to datasæt, der hver indeholder en DNA-sekvens og et DNA-kromatogram: et til den forreste primer og det andet til den omvendte primer. Undersøg først kromatogrammerne, der genereres fra hver primer. Et ideelt kromatogram skal have jævnt fordelte toppe med ringe eller ingen baggrundssignaler.
Hvis kromatogrammerne viser dobbeltspidser, kan flere DNA-skabeloner have været til stede i PCR-produkterne, og sekvensen bør kasseres. Hvis kromatogrammerne indeholdt toppe af forskellige farver på samme sted, forvekslede sekventeringssoft .aren sandsynligvis nukleotider., Denne fejl kan manuelt identificeres og rettes i tekstfilen. Tilstedeværelsen af brede toppe i kromatogrammet indikerer et tab af opløsning, hvilket forårsager miscounting af nukleotiderne i de tilknyttede regioner. Denne fejl er vanskelig at rette, og uoverensstemmelser i nogen af de efterfølgende trin skal behandles som upålidelige. Dårlig kromatogramlæsekvalitet, indikeret ved tilstedeværelsen af flere toppe, forekommer normalt ved de fem primære og tre primære ender af sekvensen. Nogle sekventeringsprogrammer fjerner disse sektioner af lav kvalitet automatisk., Hvis din sekvens ikke blev afkortet automatisk, skal du identificere fragmenterne af lav kvalitet og fjerne deres respektive baser fra tekstfilen.
brug et DNA-samlingsprogram til at samle de to primersekvenser i en kontinuerlig sekvens. Husk, at sekvenser opnået ved hjælp af fremadrettede og omvendte primere delvis skal overlappe hinanden. I DNA-samlingsprogrammet indsættes de to sekvenser hurtigtet format i den relevante boks. Klik derefter på knappen Send og vent på, at programmet returnerer resultaterne.
for at se den samlede sekvens skal du klikke på Contigs under fanen Resultater., Vælg monteringsdetaljer for at se detaljerne i justeringen. Naviger til websiteebstedet for det grundlæggende lokale justeringssøgningsværktøj eller BLAST, og vælg nukleotidblastværktøjet for at sammenligne din sekvens med databasen. Indtast din sekvens i tekstfeltet forespørgselssekvens,og vælg den relevante database i rullemenuen. Til sidst skal du klikke på BLAST-knappen nederst på siden og vente på, at værktøjet returnerer de mest lignende sekvenser fra databasen.
i dette eksempel er det øverste hit B., subtilis stamme 168, viser 100% identitet med sekvensen i BLAST databasen. Hvis det øverste hit ikke viser 100% identitet til din forventede art eller Stamme, skal du klikke på den rækkefølge, der passer bedst til din forespørgsel for at se detaljerne i justeringen. Justerede nukleotider vil blive forbundet med korte lodrette linjer, og uoverensstemmende nukleotider vil have huller mellem dem. Med fokus på de identificerede uoverensstemmende regioner skal du revidere sekvensen og gentage BLAST-søgningen, hvis det ønskes.