V dubnu tohoto roku jsme byli svědky jednoho z nejvíce monumentální úspěchy v biologii: kompletní sekvenování lidského genomu. Dekódování a databáze ukládání miliard základen sekvence je výchozím bodem postsequence funkční genomiky. Objev periodické tabulky měl důležitý dopad na chemii., Také úplné dešifrování lidského genomu bude mít působivé účinky na lidské zdraví a kvalitu života. V současné době chápeme funkci pouze omezeného počtu lidských genů. Studium všech funkcí lidských genů je technologickou výzvou. Abychom čelili této výzvě, byly vyvinuty nové vysoce výkonné nástroje. Na microarray testu je výkonný molekulární technologie, která umožňuje simultánní studii expresi tisíců genů nebo jejich RNA produkty, dávat přesný obraz genové exprese v buňce nebo vzorku v době studie.,
například, exprese všech genů pro rezistence a metabolismu nebo všech známých onkogenů v buňce mohou být detekovány a měřené ve stejném časovém horizontu (Hnědá a Botstein, 1999; Collins, 1999; Lander, 1999). Mikroarray může být definován jako uspořádaná sbírka mikrospotů (sond), každé místo obsahující jediný druh nukleové kyseliny a představující zajímavé geny. Tato technologie je založena na hybridizaci mezi označeny zdarma cíle odvozené z biologického vzorku a množství různých DNA sond, které jsou imobilizovány na matice (Southern et al.,, 1999). Cíle jsou produkovány reverzní transkripcí a současným označením RNA extraktů z biologického vzorku hybridizovaného sondami fragmentů DNA. Hybridizační signál produkovaný na každé sondě je úroveň exprese mRNA odpovídajícího genu ve vzorku v době studie. Signály jsou detekovány, kvantifikovat, integrované a normalizovaný specializovaný software a odrážet ‚gene expression profile „nebo“ molekulární portrét‘ pro každý biologický vzorek.,
mnoho tisíc nebo desítek tisíc různých skvrn lze vytisknout na křemíku nebo skleněném skluzu nebo na nylonové pevné bázi. Tam jsou hlavně dvě varianty microarrays: cDNA a oligonukleotidových microarrays (Schena et al., 1995, 1996; Lockhart et al., 1996). Ačkoli oba typy mikroarray se používají k analýze genové exprese vzory, tyto varianty jsou zásadně odlišné (Lipshutz et al., 1999). V cDNA microarrays jsou relativně dlouhé molekuly DNA imobilizovány na pevném povrchu. Tento typ mikroarray se většinou používá pro rozsáhlé screeningové a expresní studie., Na oligonukleotidových microarrays je vyrobena in situ světlo-režie chemickou syntézou nebo konvenční syntézy následuje imobilizace na skleněné matrici. Tento microarray se používá pro detekci mutací, genové mapování a studie exprese a umožňuje pro diferenciální detekce genové rodiny nebo alternativní transkripty, které nejsou rozlišitelné pomocí cDNA microarrays.
chemie mikroarray sama o sobě není nová, protože hybridizační technologie je již po desetiletí dobře zavedená., Současná studie tisíců genů však transformuje techniku mikroarray na silný analytický nástroj celého systému. Od vytvoření prvních mikroarrays uplynulo téměř 10 let, a přesto se tato technologie stále zlepšuje a postupuje. Od svého počátečního zavedení se počet mikroarray aplikací rozšířil (Obrázek 1). Od jejich použití v genu screening a identifikaci cíle, tato technologie je nalezení nových aplikací, jako jsou vývojové biologie, nemoc, klasifikace, cesta studií, léčiv a toxikologii., Technologie výroby a použití microarray je nad rámec této recenze, ale byl značně přezkoumána jinde (Schena et al., 1995; Niemeyer and Blohm, 1999; Bowtell, 1999; Brown and Botstein, 1999; Celis et al., 2000; Cheung et al., 1999; Duggan et al., 1999; Graves, 1999; Khan et al., 1999; Hegde et al., 2000; Meldrum, 2000). Popíšeme zde některé z nedávného vývoje a výsledků v microarray technologie ve výzkumu rakoviny, diskutovat případné problémy, popsat klinické aplikace a komentář o budoucnosti této technologie.,
Počet citací nalezených v MEDLINE vložením ‚microarray‘ (šedý pruh) nebo ‚microarray+rakovině (bílý pruh) na PubMed search. Články byly publikovány mezi roky 1995 a 2002
důležitost měření globální genové exprese v lidských nádorech
Charakterizující obyvatelstvo z transkribovaných genů vedla k vytvoření nového termínu, transcriptome (Su et al., 2002)., Tento koncept definuje kompletní sadu transkribovaných genů vyjádřených jako messenger RNA pro určitý druh. Transkriptom tedy představuje vesmír poslů RNA, kteří mohou kódovat proteiny. Pouze přibližně 5% genů je aktivní v určité buňce v daném okamžiku. Většina genů je potlačena a tato kontrola může nastat buď na transkripční nebo translační úrovni. Vzhledem k tomu, že regulace exprese bílkovin na úrovni transkripce je účinnější, většina kontroly probíhá na této úrovni., Profil genové exprese buňky určuje jeho funkci, fenotyp a reakci na vnější podněty. Profily genové exprese proto mohou pomoci objasnit buněčné funkce, biochemické dráhy a regulační mechanismy. Kromě toho mohou profily genové exprese buněk/tkání onemocnění ve srovnání s normálními kontrolami podporovat pochopení patologie onemocnění a identifikovat nové terapeutické intervenční body, zlepšit diagnózu a vyjasnit prognózu.,
během posledních několika let se objevilo několik metod profilování genové exprese a bylo úspěšně aplikováno na výzkum rakoviny. Patří mezi ně diferenciální zobrazení, sériová analýza genové exprese a mikroarrays (Velculescu et al., 1995; Granjeaud et al., 1999; Cheng et al., 2002). Mikroarrény se staly důležitými, protože jsou snadněji použitelné, nevyžadují sekvenování DNA ve velkém měřítku a umožňují paralelní kvantifikaci tisíců genů z více vzorků., Genová exprese profilování rakoviny představuje největší kategorii výzkumu pomocí mikroarray technologie a zdá se, že nejkomplexnější přístup k charakterizaci rakoviny molekulárně. Ačkoli je fenotyp rakoviny jen částečně určen jeho transkriptomem, stále poskytuje jasný obraz fyziologického stavu buňky. Sílu tohoto přístupu byla prokázána ve studiích prováděných na rozsáhlou řadu malignit, včetně rakoviny prsu, hlavy a krku, jater, plic, vaječníků, slinivky břišní, prostaty a žaludku (Bhattacharjee et al.,, 2001; Dhanasekaran et al., 2001; Garber et al., 2001; Tonin et al., 2001; Al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen et al., 2002; Han et al., 2002; Hedenfalk et al., 2002; Hroch et al., 2002; Luo et al., 2002a).,ve srovnání s odpovídající kontrolní vzorek pro měření rozdíly a podobnosti mezi oběma fenotypy, rakovina stratifikace, ve které expresních profilů z různých vzorků stejného typu rakoviny jsou ve srovnání odhalit odlišné podskupiny lépe definovat molekulární klasifikace společného histologický typ rakoviny, a konečně časové hodnocení nádoru, ve kterém genové exprese vzory z nádoru vzorky získané z různých stádiích progrese jsou ve srovnání objasnit rozdíly mezi časným a pokročilým stadiem onemocnění., I když mnohé studie microarray analýzy v lidské onemocnění byly publikovány, uvádíme zde některé z těch, které mají klinické zájem o onkologii.
Microarray a rakoviny prostaty
Několik studií pomocí microarrays charakterizovat prostaty profily genové exprese byly nedávno zveřejněny. Tyto studie používají technologii microarray jako nástroj pro objevování genů k identifikaci genetických markerů, které diskriminují normální a rakovinné tkáně prostaty., Jednoduchý microarray studie byla provedena pomocí spatřen membrány pole analyzovat normální a rakovinné tkáně a buněčných linií (Bull et al., 2001). Membrána microarray nálezy jsou omezeny relativní necitlivost této techniky k detekci přepisy vyjádřené na nízké úrovni, a malý počet míst, které mohou být umístěny na membrány; nicméně, tato studie přinesla kandidáta markery rakoviny prostaty pro další hodnocení., Pět publikovaných studií analyzovali profily genové exprese několika tisíc genů v normální a prostaty tkáně a používá se bez dozoru hierarchické shlukování analýza třídit vzorky (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh et al., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) dokázali rozlišit normální prostatu, benigní hyperplazii prostaty (BPH), lokalizovanou rakovinu prostaty a vzorky metastatického karcinomu prostaty pomocí 9,984 element-spotted microarrays. Pomocí hierarchické analýzy shlukování, Luo et al., (2001) byli schopni rozlišovat 16 prostaty vzorky z devíti BPH exempláře na základě rozdílů v genové expresi profily, měřeno na 6,500 prvek-skvrnitý cDNA microarrays. Welsh et al. (2001a) hlášeno podobné třídění vzorků normální a maligní tkáně prostaty pomocí oligonukleotidových mikroarén. Zajímavé je, že všech pět skupin identifikovaných transmembránové serin proteázy hepsin jako zobrazení výrazně zvýšená exprese v maligní tkáně ve srovnání s normální prostatické tkáně (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al.,, 2001a; Singh et al., 2002). Mnoho dalších kandidátských markery rakoviny prostaty jako proto-onkogenu PIM1 se objevily z jiných studií a jsou dále zkoumány jako potenciální diagnostické markery. Snížená exprese PIM1 na imunohistochemii vzorků nádoru prostaty poskytla zvýšené riziko recidivy po operaci (Dhanasekaran et al., 2001). Další skupiny pomocí kombinace subtraktivní hybridizace a microarray analýzy identifikovali několik potenciálních kandidátů na rakovinu prostaty imunomodulační terapie včetně prostein (Xu et al.,, 2001), STEAP (Hubert et al., 1999) a p504S/alfa-Methylacyl-CoA-Racemáza (Jiang et al., 2001). Ve velmi nedávné studii, Virole et al. (2003) použili buněčné linie rakoviny prostaty, která vyjadřuje vysokou konstitutivní hladinu Egr1 protein, transkripční faktor, nadměrně exprimován ve většině agresivní tumorigenní buňky rakoviny prostaty. Hodnotí Egr1 transkripční regulace, provedením oligonukleotidových microarrays analýza pomocí buněk poskytnuté nedostatkem Egr1 jako srovnávací vzorek pro identifikaci Egr1 cílové geny., Poprvé v prostaty tkáně, tato studie potvrdila růst-enhancer roli Egr1 dříve pozorovány u dalších buněčných systémů, a identifikoval několik nových cílových genů, konkrétně kontrolující růst, progresi buněčného cyklu a apoptotických drah.
microarray and oral cancer
dosud bylo publikováno pouze několik studií mikroarray relevantních pro rakovinu ústní dutiny. Chang et al. (1998) ilustroval použití cDNA microarrays k charakterizaci genů souvisejících s transformací u rakoviny ústní dutiny. Villaret et al., použita kombinace komplementární DNA odčítání a microarray analýzy zhodnotit jedinečné geny specifické pro spinocelulární karcinom hlavy a krku (HNSCC) jako potenciální nádorové markery a kandidátských vakcín. Bylo zjištěno, že devět známých genů je v HNSCC významně nadměrně exprimováno ve srovnání s normální tkání. Kromě toho byly v podmnožině nádorů nadměrně exprimovány čtyři nové geny (Villaret et al., 2000). Alevizos et al. (2001) analyzoval transkriptom v karcinomu skvamózních buněk ústní dutiny., Našli asi 600 kandidátních genů (onkogeny, nádorové supresory, transkripční faktory, diferenciace značky, metastatické cizorodých bílkovin a enzymů), které byly rozdílně vyjádřené v rakovinu ústní dutiny, ověřování pouze tři z těchto genů pomocí PCR.
Lu et al. (2001) použil přístup microarray k vyhodnocení změn profilu genové exprese během zahájení a progrese spinocelulárního karcinomu jícnu., Zkoumali profily genové exprese v různých stádiích zahájení a progrese rakoviny jícnu, aby identifikovali geny odlišně vyjádřené mezi těmito stadii. Frierson et al. (2002) použili oligonukleotid analýza microarray pro studium exprese 8,920 různých lidských genů v 15 adenoidně cystické karcinomy (ACCs), jeden ACC buněčné linie a pět normálních velkých slinných žláz., Mezi geny se změněnou expresí v ACC byly ty, kódující transkripční faktory SOX4 a AP-2 gama, kasein kinázy 1, stejně jako epsilon a frizzled-7, z nichž oba jsou členy Wnt/beta-catenin signální dráhy. Ve velmi nedávné studii, Leethanakul et al. (2003) generované knihovny cDNA s vysokou složitostí z laserového zachycení mikrodisekovaného normálního a rakovinného dlaždicového epitelu. V této studii autoři průzkumu k dispozici informace o posloupnosti pomocí bioinformatická nástroje a identifikovat 168 nových genů rozdílně vyjádřené v normálního a maligního epitelu., Navíc pomocí polí cDNA získali důkaz, že podmnožina těchto nových genů může být vysoce exprimována v HNSCC.
Microarray a rakoviny prsu
Vzhledem k tomu, klinické heterogenity prsu, microarray technologie může být ideálním nástrojem pro stanovení přesnější klasifikaci. Počáteční studie využívající expresní profilování založené na mikroarray prokázaly svou schopnost správně klasifikovat karcinomy prsu pozitivní na estrogenový receptor a estrogenový receptor (pero a kol., 2000; West et al.,, 2001) a diferencovat nádory související s BRCA1 od nádorů souvisejících s BRCA2 a sporadických nádorů (Hedenfalk et al., 2001; van ‚ t Veer et al., 2002).
studie van ‚ t Veer et al. byl jedním z nejrozsáhlejších a informativních studií provedených k dnešnímu dni. Autoři vyšetřili 117 prsu primární vzorky pomocí microarray-based profilování genové exprese rozvíjet prognostické profily a porovnat tyto známé prognostické markery u karcinomu prsu. Z 5000 genů s variabilními expresními profily bylo identifikováno 70 pro optimální přesnost při předpovídání recidivujícího onemocnění., Pomocí této klasifikace autoři správně předpověděli skutečný výsledek onemocnění u 65 ze 78 pacientů. Pět pacientů s dobrou prognózou a osm pacientů se špatnou prognózou bylo nesprávně přiřazeno. Standardní prognostické markery u karcinomu prsu byly použity k odhadu rizika recidivy rakoviny a pomoci při rozhodování o adjuvantní terapii. Bohužel současné prognostické markery dostatečně neidentifikují nejpravděpodobnější terapii pro pacienta., Prediktivní síla přístupu microarray je mnohem větší než u aktuálně používaných přístupů, ale musí být validována ve více prospektivních klinických studiích. Pokud by byla potvrzena prognostická hodnota tohoto přístupu, klasifikátor profilující expresi by vedl k zbytečnému čtyřnásobnému poklesu u pacientů užívajících adjuvantní terapii (Caldas a Aparicio, 2002).
Martin et al. (2001) popsal metodu identifikace cirkulujícího karcinomu prsu dvoustupňovým procesem diferenciálního zobrazení a expresního profilování založeného na poli s vysokou citlivostí., I když je potenciál této techniky slibný, jeho citlivost a specificita je stále třeba zlepšit a je zapotřebí více práce k určení klinického významu detekce profilu genové exprese v periferní krvi. Některé články nyní prokázaly souvislost mezi profily exprese nádoru pomocí technologie microarray a klinickým výsledkem. Například Sorlie et al. (2001) prokázala, že podtřídy nádoru definované expresním profilováním mohou předvídat bez nemoci a celkové přežití a Sotiriou et al., (2002) ukázalo, že profily exprese před léčbou předpovídaly klinickou odpověď na chemoterapii u malého vzorku nádorů prsu. Ačkoli studium Sorlie et al. byl velmi provokativní, autoři nesrovnával prognostické hodnoty skupiny identifikovány pomocí hierarchického shlukování se v současné době používají prognostické faktory u karcinomu prsu., Od lékové rezistence v prsu je hlavní překážkou k úspěšné chemoterapie, proveditelnost získání potenciální molekulární profil nebo otisků prstů protinádorových léčiv do nádorových buněk pomocí microarray technologie je důležité předvídat chemoterapie reakci. Kudoh et al. (2000) prokázala tuto schopnost definovat změny v profilech genové exprese v buněčné linii rakoviny prsu léčené chemoterapií. Sledovali expresní profily buněk karcinomu prsu MCF-7, které byly buď přechodně léčeny doxorubicinem, nebo vybrány pro rezistenci na doxorubicin., Tato studie ukázala, že přechodná léčba doxorubicinem změnila expresi rozmanité skupiny genů časově závislým způsobem.
Microarray a rakoviny vaječníků
v posledních několika letech, několik vyšetřovatelé zveřejnili zajímavé studie týkající se výraz profilování rakoviny vaječníků. Martoglio et al. (2000) analyzoval profily genové exprese pěti normálních vaječníků a čtyř špatně diferencovaných vzorků serózního papilárního ovariálního adenokarcinomu., Pomocí malého „in-house“ nylon membrána cDNA microarray, našli celkovému zvýšení angiogeneze související s markery (např. angiopoietin-1, VEGF), apoptotických a nádorových markerů, imunitní reakce mediátory a nové potenciální markery ovariálního karcinomu (např. cofilin, moesin a neuron-restriktivní tlumič protein faktoru) v nádorové tkáni. Studie byla zajímavá, protože používaly nízkonákladové pole cDNA přizpůsobené pro studie specifických cest, jako je angiogeneze a tumorigeneze., Protože to je problematické pro přístup k adekvátní množství předčasné ovariální nádorové tkáně, vědci používají různé strategie, jak obejít potřebu tkáně částky obvykle vyžadované microarray analýzy. Například Ismail et al. (2000) uvádí studii 864 DNA prvky chráněny před 10 vaječníků rakovinné buňky, řádky a pěti normálních epiteliálních buněčných linií pomocí krátkodobé buněčné kultury rozšířit ovariální povrchový epitel před RNA extrakce., Jiní vyšetřovatelé čistí ovariální epitel in vitro postupy, jako je například přilnavost ke sklu nebo imunomagnetické obohacení (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b). Tyto dva přístupy však mohou představovat předsudky v pozorované genové expresi. Ve skutečnosti, první přístup (Ismail et al., 2000) používá Kultivované rakovinné buňky, které nemusí odrážet in vivo rakoviny kvůli možnosti sekundárních změn genové exprese, ke kterým dochází in vitro v důsledku kultivačních podmínek. Druhá strategie (Ono et al., 2000; Welsh et al.,, 2001b) je velmi dlouhá a může vést k degradaci méně stabilních poslů RNA. Aby se zabránilo možným předsudkům in vitro kultury používané v některých studiích (Ismail et al., 2000; Matei et al., 2002), další vyšetřovatelé studovali vzorce genové exprese přímo z chirurgicky resekovaných nádorů (Shridhar et al., 2001). Malé, specializované microarrays mají několik praktických výhod a může odhalit informace, které mohou být ztraceny ve větších microarrays. Sawiris et al., (2002) používá vysoce specializované cDNA microarray s názvem ‚Ovachip‘, a našel tohle microarray extrémně citlivý na rozlišování rakoviny vaječníků, rakoviny tlustého střeva na základě genové exprese vzory. Screening biomarkery pro rakovinu vaječníků jsou velmi důležité, protože pozdní fázi při diagnóze a špatné přežití spojené s tímto typem rakoviny., V poslední době, dvě studie, které microarray technologie k identifikaci dvou nadměrně exprimován potenciální rakoviny vaječníků sérových markerů, tzv. osteopontin a prostasin, a uvádí předběžné ověření jejich použití pro včasnou detekci onemocnění (Mok et al., 2001; Kim et al., 2002).
mikroarray a další rakoviny
aplikace mikroarray technologie na jiné lidské rakoviny se rychle rozšiřuje. Průkopnické studium Golub et al., (1999) prokázala možnost odlišit akutní myeloidní leukémie a akutní lymfoblastické leukémie (ALL) na základě genové exprese sledování a jak, v simulované situaci ‚slepý‘ na histologické diagnóze, dvě třídy mohl být objeven genové exprese vzory sami. Alizadeh et al. (2000) identifikoval dvě formy difúzního velkobuněčného B lymfomu (DLBCL) na základě profilů genové exprese, které svědčí o různých stádiích diferenciace B-buněk., Je zajímavé, že tato molekulární klasifikace má prognostickou hodnotu nezávislou na stratifikaci obvyklým klinickým hodnocením. Pro studium genové exprese u lymfoidních malignit, velké společné skupiny vytvořené specializované microarray, s názvem ‚Lymphochip‘, který je obohacen geny, které jsou selektivně vyjádřené v lymfocytech a v genech regulujících funkci lymfocytů (Alizadeh et al., 1999). Tato skupina použila tento mikroarray k vyšetření DLBCL a našla dvě molekulárně odlišné formy tohoto nádoru., Dále prokázali, že podskupiny DLBCL definovaly podskupinu pacientů s výraznou klinickou prognózou. Testovat hypotézu, že B-buněčná chronická lymfocytární leukémie (CLL) je více než jedno onemocnění, Rosenwald et al. (2001) související genové expresní vzorce CLL s jejich mutačním stavem Ig a s jinými typy normálních a maligních B buněk. Je zajímavé, že geny identifikované jako vysoce exprimované v CLL ve srovnání s DLBCL byly ekvivalentně vyjádřeny ve všech vzorcích CLL bez ohledu na jejich mutační stav Ig., Tato studie naznačila, že všechny případy CLL sdílely společný mechanismus transformace a/nebo buňky původu. Nedávná studie (Stratowa et al., 2001) navrhla seznam potenciálních nových prognostických markerů podílejících se na obchodování s lymfocyty a souvisejících se stádiem onemocnění a/nebo přežitím pacientů.
ve velmi nedávné studii Gariboldi et al. (2003) analyzovali profily genové exprese v normální tkáni nádoru kůže-citlivé a rezistentní myši s cílem identifikovat geny, které hrají funkční roli v genetické náchylnosti., Tato studie navrhla roli Scca2 gene, člen serin proteázy nadčeleď, v genetické predispozice k kožní nádory.
Mikroarray technologie byla také použita při analýze melanomu (Bittner et al., 2000). Tato studie naznačila, že expresních profilů v rámci jednotlivých tkání pacienta může být pozoruhodně zachovány v průběhu času, a že globální přepis analýza může identifikovat neznámé subtypy kožního melanomu a předvídat experimentálně ověřitelné phenotypical vlastnosti.,
studie na nádorových buňkách a tkáních tlustého střeva prokázaly významné potlačení genu kinázy, WEE1Hu (Backert et al., 1999).
mnoho transkriptomů se mění po specifické nadměrné expresi genů souvisejících s nádorem. Například jsme využili adenovirem zprostředkovaný výraz systém s příponou rb2/p130 tumor-supresorového genu v non-malá buňka rakovina plic-line s cílem identifikovat konkrétní geny, které jsou regulovány pRb2/p130 (Russo et al., 2003)., Naše výsledky microarray identifikovali řadu genů, zapojených do mnoha buněčných procesů včetně buněčného dělení, buněčná signalizace/buněčné komunikace, buněčné struktury/pohyblivost a genové exprese a metabolismu. Tyto výsledky naznačují nové potenciální terapeutické biomarkery u karcinomu plic. Kromě toho, výsledky další cDNA microarray studie naznačují, že zvýšená exprese tumor-supresorový gen PTEN může inhibovat rakovinu plic invazi downregulating panelu genů (Hong et al., 2000)., Vzhledem k výše uvedeným údajům je zřejmé, že přístup microarray je velmi důležitý při analýze různých typů nádorů.