struktura Telomer — Funkční vztah
Jak už bylo řečeno, v nepřítomnosti telomerázy, telomery se non-funkční, zkrátit s po sobě jdoucích buněčných dělení, a chromozom termini můžete pojistka v důsledku de-ochranu. Telomere fúze jsou výsledkem non-homologní-end-spojování (NHEJ), který je jedním z převládajících mechanismů dvojitého přerušení vlákna (DSB) léčení., V důsledku těchto událostí by mohlo být vytvoření chromosomů nesoucí více než jeden centromery, což bude pravděpodobně umístěni na opačných pólech během mitózy, což vede k poškození chromozomů a další genomické nestability přes opakované fusion – rozbití události. V obratlovců, role chromozomu end ochranu, aby mohly být odlišeny od chromozomů je určitý komplex proteinů, souhrnně označované jako ochranu. Shelterin komplex je v podstatě složen ze šesti proteinů., Dva členové shelterinového komplexu, TRF1 a TRF2 (od Telomer Repeat-binding Factor 1 a 2) vázat přímo na dvouvláknovou telomerní sekvence, zatímco POT1 váže ssDNA. TRF2 spolupracuje s RAP1 a rekrutuje, zatímco TIN2 zprostředkovává vazbu TPP1 – POT1 na jádrový komplex TIRF1 / TIRF2. POT1 se váže a chrání 3 jednovláknové DNA převis telomer (g-tail), zatímco TIN2 pravděpodobně spojuje jednovláknové a dvouvláknové DNA vazebné komplexy, zejména v oblasti tvorby telomerní d-smyčky (obrázek 3)., Zdá se, že toto jádro shelterinu komplex se nachází především na konci telomer (také odkazoval se na jako telosome) a slouží i při stabilizaci t-loop struktury, chrání ve stejné době, bude rozpoznán jako poškození DNA a opravit pomocí NHEJ. Shelterin navíc reguluje přístup k obnovovacím procesům telomerní DNA po každé replikaci genomu., Obecně platí, shelterinového komplexu, zdá se, že funguje jako platforma upravující přijímání rostoucího seznamu faktory, podílející se na remodelaci chromatinu, replikace DNA, opravy poškození DNA, rekombinace a funkce telomerázy, tedy regulace telomer přístupu / modifikace u různých buněčných procesů (viz obrázek 4), nedávno přezkoumána .
Číslo 3.
Schematický model potenciálního telomerového uzavíracího uspořádání komplexem shelterin., Proteiny komplexu shelterin se podílejí na ochraně telomer, replikaci a regulaci délky. Proteiny TRF1 a TRF2 se váží specificky na telomerickou dna ds, zatímco POT1 (TPP1) rozpoznává ssDNA (stabilizující d-smyčku). TIN2 propojuje ssDNA s vazebnými komplexy dsDNA, stabilizující telosomovou strukturu. Telomerní DNA se skládá z opakující se sekvence DNA, duplexní oblasti a převisu G-řetězce ssDNA (g-strand, oranžová; C-strand, modrá). Komplex shelterin se váže jak na duplexní, tak na ssDNA oblasti prostřednictvím specifických interakcí protein-DNA., Tvorba t-smyčky zahrnuje invazi vlákna g-převisu, aby se vytvořila posunovací smyčka (d-smyčka). T-smyčka je navržena tak, aby maskovala chromozomový konec ze senzorů poškození DNA. Komplex shelterin je z prostých důvodů znázorněn jako komplex šesti proteinů homogenně dispergovaný na telomeru. Viz text pro další podrobnosti.
Zajímavé je, zdá se, že více než jeden typ základní shelterinu komplex existuje, a ne všechny z nich jsou nutně součástí telosome. Byly detekovány komplexy obsahující pouze TRF1-TIN2-TPP1-POT1 nebo TRF2-RAP1., Nedávné údaje měření absolutní a relativní množství TRF1 a TRF2 v buňce ukázalo, že TRF2 je asi dvakrát tak bohaté jako TRF1 a to je v souladu s TRF2 byla zjištěna v prostorově zaměřena poškození DNA vyvolané ložisek v non-telomerické chromozomu regionů. Nábor TRF2 na místa poškození DNA je v souladu s tím, že hraje klíčovou roli v reakci na poškození DNA . Složitost sítě vytvořené telosomem je prakticky založena na jedinečných strukturálních vlastnostech členů shelterinu., TRF1 a 2 nést SAB/MYB domény, kterou obě strany uznávají a TTAGGGTTA motiv na telomer ds DNA, kyselé bohatý (D/E) terminál regionu a konkrétní dokovací motiv označuje jako TRF homologie (TRFH) motiv . Doména TRFH zprostředkovává homo-dimerizaci TRF1 nebo TRF2, ale zakazuje heterodimerizaci kvůli strukturálním omezením . Pro vazbu TRF1 a TRF2 je vyžadován motiv fxlxp a motiv y/fxlxp. Tyto domény jsou označovány jako TRFH vazebné motivy (TBM). Aminokyselinový zbytek Phe 142 v motivu TRF1-TRFH je zodpovědný za vazbu TIN2 prostřednictvím oblasti TBM., TIN2-TBM výrazně nižší afinitu pro daný region TRF2 (Phe 120) v důsledku strukturálních rozdílů v blízkosti Phe 120 a konečně je připojen k TRF2 pomocí unikátní TRF2 oblasti poblíž N-konci proteinu. Nicméně, Phe 120 reziduí je rozhodující pro specifické interakce s jinými telomer související faktory, jako je Apollo nuclease, TRF2 závazné partnera. Tvorba komplexů mezi shelterinového jádro členů a přidružených faktorů s TBM jako motivy jsou pravděpodobné, že bude také v režii změny ve vazebné afinity vzhledem k post-translační modifikace., Pěkný příklad je TRF1 parsylation tím, tankyrase, což má za následek významné snížení DNA-TRF1 afinitu, což umožňuje prodloužení telomer a sestra telomery oddělení specificky zmírňuje soudržnosti komplex z TRF1 a TIN2 . Nerovnováhy těchto interakcí by mohly být škodlivé pro celistvost genomu, jak ukázaly zvýšené hladiny TIFS tvoří v buňkách se zvýšenou expresí izolované TBM jako tandem YRL opakovat. Analogické škodlivé výsledky byly získány při vyjádření substituční alely TRF2-F120 .,
Nedávné strukturální studie jednoho ze dvou OB (Oligonukleotid/oligosacharid-závazné) záhyby. S. pombe Pot1, které tvoří vazebné místo ssDNA, bylo zjištěno, že non-specifické nukleotidové uznání ssDNA je dosaženo tím, že dosud neidentifikované závazné režimy, které termodynamicky kompenzovat base-substituce prostřednictvím alternativní stacking interakce a nové H-propojení sítí . Očekává se tedy, že detailní vymezení struktury shelterinových členů a souvisejících faktorů geometricky zlepší naše chápání sítí a způsob kvantity vs., změny kvality narušují strukturální modifikace vedoucí k funkčním změnám, jemné ladění stability genomu. Nepochybně množství shromážděných informací již připravilo způsob použití anti-telomerázových činidel v klinických studiích s robustním očekávaným výsledkem.
kromě shelterina a interagujících partnerů se nedávno objevil další významný komplex, který se také podílí na telomerově biologii, komplexu CST. CST komplex se skládá z CTC1, STN1 (OBFC1) a TEN1, a byla připsána záchrana zastavené replikační vidlice během replikace stresu., Komplex CST propojuje telomery s replikací genomu a ochranou nezávisle na cestě Pot1 .
Hromadí se důkazy o četných publikací zcela neočekávaně prokázala, že odpověď poškození DNA (DDR) a opravy dráhy, i přes zdánlivý paradox, sdílejí společné vlastnosti s telomer údržbu strategií. DDR včasné reakce proteiny jsou přijímáni na telomery a proteiny, předpokládá, že funkce v udržování telomer byly také prokázáno, že být zapojen do DDR., Paradoxně se zdá, že faktory DDR v telomerách za normálních podmínek narušují obnovu telomer a zachování délky. Tento zřetelný jev je přičítán shelterin koordinaci DDR faktorů přístupu a funkce v telomeres. TRF2 se může vázat a potlačit ATM, zatímco POT1, když je vázán na G-ocas přes TPP1, inhibuje ATR. Potlačení TRF2 činnost vyvolává p53 a ATM aktivace, což vede k telomer dysfunkce indukované ložisek (TIFs). TIFs výsledek v end-to-end fúze telomer pomocí NHEJ dráhy a jejich výskyt koreluje s indukcí senescence ., Souhra se zdá být založen na ochranu množství a délky telomer, dva parametry se přímo vztahují k sobě navzájem, jako když telomery jsou kriticky krátké jsou méně pravděpodobné, že tvořit t-loop, reakce katalyzované TRF2 in vitro, a naopak méně shelterinového je vázána na . V důsledku toho jsou výrazně sníženy dvě hlavní struktury údržby telomer (povlak t-loop a shelterin), což umožňuje aktivaci DDR., Přesto docela zajímavě, NHEJ stroje mohou také vykonávat ochrannou roli v telomer pomocí enzymatické aktivity Tankyrase týkající se propagace DNA-PKcs stability a předcházení vzniku telomer výměna sesterských chromatid (Sce), jak je produkt inter-telomer rekombinace
Další zajímavé paradigma je MRN komplex (protein komplex meiotické rekombinace 11 (MRE11) – RAD50 a NBS1 proteiny), kde jeden NBS1 molekula je spojena s dvěma dimery z MRE11 a RAD50 ., Proteiny MRE11 a RAD50 tvoří heterotetramer, který obsahuje dvě domény vázající DNA a zpracování, které mohou překlenout volné konce DNA . MRN komplex lokalizuje na telomer v průběhu S a G2 fází buněčného cyklu prostřednictvím přímé interakce NBS1 s TRF2, pravděpodobně přispívá k G-tail formace na předních telomerické pramen, a tedy stability telomer ., U člověka, mutace v NBS1 genu vede k chromozomální nestabilitě poruchy, Nijmegen breakage syndrom 1, spojené se zvýšenou citlivostí k ionizujícímu záření a chromozomální nestability a počátkem vzniku rakoviny i v NBS1+/- heterozygoti. NBS1 obsahuje doménu spojenou s forkhead (FHA), doménu BRCT (BRCA1 C Terminus), doménu vázající mre11 a doménu interagující s ATM. Hromadí se důkazy, ukazuje, že NBS1 interaguje s telomery a přispívá k jejich stabilitě, alespoň v lidské a myší buňky., Nepřímé imuno-fluorescenční experimenty odhalily, že NBS1 co-lokalizuje s TRF2 během S fáze, v kultivované HeLa buněk , případně modulací t – smyčky formace. Jako TRF2 bylo také zjištěno, že na non-telomerické sekvence dopad NBS1 co-lokalizace s TRF2 vyžaduje další objasnění. Podobně u myších embryonálních fibroblastů byl pozorován aktivní nábor NBS1 do dysfunkčních telomer . Zdá se, že komplex MRN hraje dvojí roli v biologii telomer. Jedním z nich je zprostředkovat alespoň částečně odpověď ATM vedoucí k tvorbě TIF po odstranění TRF2 ., Za druhé, jeho nuclease činnost, je nutné pro normální telomer formace, jako MRN je zapojen do zpracování poškozených telomery tím, že ovlivňuje produkci převis od tupým koncem telomer vytvořené po replikace telomer . Takové zrychlení tvorby g-ocasu, po dysfunkci telomer / de-protection, zabraňuje fúzi předních tupých pramenů de-chráněných telomer během fáze S. Nukleáza Apollo může být také rekrutována a zapojena do tohoto procesu., Přímé interakce NBS1 s telomer repeat-binding factor 1 (TRF1) bylo prokázáno, že pro zvěčněn telomerázy negativní buňky, z čehož vyplývá, že tato interakce může být zapojen do alternativní prodlužování telomer. Kromě toho, v telomerázy vyjádření buněk, MRN komplex, prostřednictvím downregulace a odstranění TRF1 (NBS1-dependentní fosforylace TRF1 ATM) může také podporovat dostupnost telomerázy k 3 konci telomer ., Opravy DNA telefony s telomer stabilita je vztah poměrně brzy v evoluci, jak je uvedeno v tom, že MRE11 a RAD50 společně s protein kináz ATM a ATR, jsou také nezbytné pro správné udržování telomer u rostlin .
Obrázek 4.
shelterin související faktory, které se také podílejí na reakci na poškození DNA., Podrobnosti v textu,
v Poslední době, další protein fosfatázy, PNUTS (fosfatázy 1 jaderné cílení podjednotka), který interaguje s TRF2, vloží další kousek skládačky z DDR a telomer vztahu . Kromě toho, detekován genomovým hledáním proteinů obsahujících TBM, tři BRCT doména nesoucí MCPH1 proximální DDR faktor také interaguje s TRF2. Mutace MCPH1 jsou spojeny s vývojovými defekty a zvýšeným výskytem nádoru ., Mcph1 vyčerpané buňky představují snížené hladiny BRCA1 a Chk1 a jsou vadné v kontrolním stanovišti G2/m.
zásadní roli v integritě telomer je také přičítána BRCA2, klíčové složce HR DNA repair pathway. BRCA2 spolupracuje s telomery během fází buněčného cyklu s / G2 a zdá se, že usnadňuje rekombinázové zatížení RAD51 . Proto je pro údržbu délky telomer vyžadována HR aktivita zprostředkovaná BRCA2. Tato zjištění mohou alespoň částečně vysvětlit kratší telomery nalezené u mutovaných lidských nádorů prsu BRCA2., Proto může být telomerová dysfunkce také zapojena do genomické nestability pozorované u karcinomů prsu a vaječníků s nedostatkem BRCA2 .
celkem, počet oprav DNA molekuly, které jsou společně součástí HR, NHEJ, NER a Fanconiho Anémie drah bylo zjištěno, že být přijati na telomery, s TRF2 hlavně funguje jako protein hub., Za normálních podmínek, ATM/ATR signalizace, na de-ochrana z důvodu krátké délky telomer a následné ‚odchod do důchodu‘ buňky (senescence / apoptóza) je součástí běžné, nádor-zahájení ochranný mechanismus proti genomu-destabilizoval buněk. V buňkách nesoucích normální délku telomer existují inhibiční vztahy mezi těmito různými systémy opravy DNA, které brání vzájemné aktivaci.
telomery jsou součástí heterochromatinové struktury, což znamená, že specifické signály definují jejich umístění v jádru., I když skutečnost, že telomery se očekává, že být ze své podstaty stabilní a inertní koncích chromozomů, nicméně se zdají být dynamické nukleoprotein komplexy také podílí na remodelaci chromatinu. Nábor heterochromatin vazebného proteinu HP1 , obohacený tri-methylace histonu H3 lysinu 9 (H3K9) a H4K20 , stejně jako methylace CpG dinucleotides v subtelomeric DNA opakuje podporu tohoto pojmu. Tyto heterochromatické značky jsou nahrazeny charakteristikami otevřeného chromatinu(zvýšená acetylace na histonových ocasech atd.) když se telomery zkracují., Tyto změny znamenají, že minimální délku telomer je zapotřebí k udržení heterochromatin–jako struktury na koncích chromozomů, struktura, která může změnit tyto telomery opotřebení. Kromě toho by telomery a komplex shelterin měly uvolnit svou těsnou strukturu během replikace chromozomů a znovu vytvořit kompaktní formu po dokončení duplikace DNA. Analogické uvolnění telomerní struktury by mělo být vyžadováno v případě obnovy telomer pomocí mechanismů opravy telomerázy nebo DNA, i když možná prostřednictvím odlišných postupů., Za účelem dosažení této plasticity by měl být chromatin remodelován řadou enzymů podle místního histonového kódu . Zahrnuje se řada modifikací histonu, kde odlišné interakce histonu s ocasem a proteinem podporují relaxaci nebo kompresi komplexní struktury telomer . Jako příklad, SIRT6 (histonu H3K9 deacetylase, že moduluje telomerické chromatinu) vyčerpání pokusů o RNA interference za předpokladu, důkazy o zvýšené jaderné DNA poškození a vzniku dysfunkce telomer-indukovaných ložisek., Tyto experimenty naznačují, že SIRT6 chrání endoteliální buňky před telomer a genomické DNA poškození, čímž se zabrání snížení replikační kapacity a nástupu předčasného stárnutí, v tomto konkrétním případě podílí na zachování endoteliální homeostatických funkcí a zpoždění cévní stárnutí.
Další důležitý soubor faktorů podmiňujících v biologie telomer je produkty ATRX a DAXX geny, které se podílejí na remodelaci chromatinu spolu s histonu H3.3 ., Mutace nebo delece v těchto genetických lokusů byly přímo spojeny s ALT+ stav na buněčných liniích nebo nádory per se . Podle těchto zjištění může screening mutací/exprese ATRX/DAXX představovat nejspolehlivější marker nádorů, které si zvolily cestu ALT TMM.,
Společně, to je správné montáži shelterins v telomer, který je zásadní pro stabilitu chromozomu (rozlišuje koncích chromozomů z DNA ds přestávky a zabraňuje ztrátě genetické informace, a to buď prostřednictvím nucleolytic útok (exonuclease-zprostředkované degradaci) nebo aberantní chromozom fúzí a nežádoucí rekombinace, během buněčného života., Spolu s řádnou strukturu, funkční koordinace kontrolní TMM a aktivity telomerázy jsou přísně regulovány v průběhu celého buněčného cyklu tím, že řada zapletený příslušenství faktory, přechodně zaměstnaní shelterinového komplexy / subcomplexes .
kromě jejich ochranné úlohy umožňuje správná interakce shelterinů se složkami strojů na opravu DNA, jakož i komponenty telomerázy a nábor telomerázy v případě potřeby obnovu telomer., Důležitost, jaká struktura – funkce shelterinu komponenty v telomer biologie a tvorbě rakoviny, spolu s telomer-asociovaných onemocnění, jsou znázorněny asociace mutace detekce v tj. TIN2 v mnoha z těchto případů .