pozorování
velká část pokroku v mikrobiologii závisí na studiu “ čistých kultur.“Jedná se o kultury, které obsahují pouze jeden typ buňky, ideálně s kulturou odvozenou z počáteční jediné buňky., Od raného vývoje metod pro stanovení čistých kultur (1) Existuje mnoho příkladů, kdy bylo následně zjištěno, že kultury, které byly původně považovány za čisté, obsahují dva typy mikrobů. V některých případech tyto neúmyslné vícedruhové kultury vedly k důležitým průlomům, jako je objev mezidruhového přenosu vodíku (2). S příchodem technologií hlubokého sekvenování však lze rozumně předpokládat, že nezjištěné kontaminanty v kulturách již nebudou významným problémem.,
Geobacter sulfurreducens kmen PCA byl izolován v polovině-1990, a to pomocí standardního obohacení a izolace technik, které zahrnovaly ředění k zániku v kapalné médium, následuje opakované pruhy izolovaných kolonií na agaru-ztuhnutí média (3). Toto je klasická strategie vyučovaná v nejpopulárnějších úvodních učebnicích mikrobiologie (4-6). Později byl g. sulfurreducens kmen DL1 získán dalším restreakingem izolovaných PCA kolonií (7). S vývojem metod pro genetickou manipulaci s G. sulfurreducens (7) a sekvenováním jeho genomu (8), g., sulfurreducens se stal Geobacterovým druhem volby pro studium fyziologie a nových extracelulárních vlastností přenosu elektronů tohoto ekologicky důležitého rodu (9). Počáteční sekvenování 16S rRNA genu v kultuře (3), stejně jako sekvenování genomu, první 8-krát (8) a pak na 80-krát (10, 11) pokrytí, je uvedeno, že kultura obsahovala pouze jeden kmen.,
Ve snaze adaptivně vyvíjet DL1 vyrábět více proudu, to byl naočkován do bioelektrické systém s grafit anody připraven na potenciální (-400 mV vs. Ag/AgCl) považovány za v blízkosti spodní hranice, při které současná generace z acetátu by bylo možné (12). Izolát získaný z anodového biofilmu označeného G., sulfurreducens kmen KN400 (12), je lepší, aby inokula kmene na výrobu elektrického proudu, a tato převaha je připsat alespoň zčásti jeho schopnost produkovat více „mikrobiální nanodrátky,“ elektricky vodivé proteinových vláken, které vykazují kovové-jako elektrická vodivost (13, 14).
původně se předpokládalo, že kmen KN400 nashromáždil jednu nebo více mutací, které zvýšily jeho kapacitu pro extracelulární přenos elektronů., To by bylo analogické výběru mutantních kmenů během adaptivního vývoje kmene DL1 pro výměnu elektronů s jinými organismy (11) nebo vyšší rychlosti redukce oxidu Fe(III) (10). Nicméně, srovnávací genomika bylo zjištěno, že sekvence genomu kmene KN400 obsahoval více než 27,270 jednonukleotidových polymorfismů (Snp) (15). Třetina genů měla alespoň jeden nukleotidový polymorfismus a čtvrtina měla polymorfismus, který ovlivnil výslednou proteinovou sekvenci (15). Na základě typických mutačních poměrů 6.,3 × 10-9/bp na generaci (16) by trvalo více než 1 000 let, než by se nahromadilo tolik mutací v kmeni DL1. Kromě toho, nejsou tam žádné orthologs v DL1 kmen pro 139 otevřené čtecí rámce (Orf) v KN400 kmen genomu, z nichž většina jsou nejvíce úzce souvisí s geny ve fylogeneticky různorodých organismů (15).
Tyto úvahy a skutečnosti, že Orf jedinečné KN400 nebyly zjištěny, když se očkovací kultura byla upravena (10, 11) vedl k hypotéze, že KN400 vstoupil do bioelectrochemical systému jako kontaminující látky., Pro vyhodnocení této možnosti byla čistota kultury DL1 dále hodnocena s ještě vyšší citlivostí.
Oba DL1 a KN400 obsahují omcS, gen pro vnější povrch cytochromu, že má jeden z nejvyšších podílů Snp (36 Snp/kb) mezi dvěma kmeny (15). Tento gen byl zesílen z DL1 kultury, které byly použity k naočkování bioelectrochemical systému a PCR produkty byly sekvenovány s Illumina Hi-Seq 2000 (viz Text S1 na doplňkový materiál)., Sekvence KN400 byla detekována, což naznačuje, že KN400 byl přítomen v počátečním inokulu použitém pro studii výběru anody. Nicméně z >107 vysoce kvalitních sekvencí bylo obnoveno pouze 286 sekvencí KN400 oproti sekvencím 1,5 × 107 DL1 (Tabulka 1).
Text S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Toto je open-access článek distribuovaný pod podmínkami Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported license, což umožňuje neomezený nekomerční použití, šíření a reprodukce v libovolném médiu, za předpokladu, že původní autor a zdroj jsou připsány.,
- Zobrazit inline
- Zobrazit popup
Odhaduje se, kmene KN400 hojnosti v různých culturesa
Tabulka S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný podle podmínek Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.,0 Unported licence, která umožňuje neomezené nekomerční použití, distribuce, a reprodukce v jakémkoli médiu, za předpokladu, že původní autor a zdroj jsou připsány.
relativní hojnost KN400 kmen v této stejné kultury byl dále hodnocen pomocí kvantitativní PCR (qPCR) s sada primerů specifických pro gen nachází pouze v KN400 (viz Text S1 a v Tabulce S1 v doplňkové materiály) a primer set, který zjistil, jak KN400 a DL1 (viz Tabulka S1 na doplňkový materiál)., Relativní hojnost KN400-specifické sekvence byla podobná KN400 omcS sekvence určuje sekvenční přístup (Tabulka 1). Sekvenční analýza a qPCR test kultury PCA uložené v ATCC odhalily přítomnost KN400 při podobné nízké hojnosti (Tabulka 1).
Jsme se pokusili odstranit vzácné KN400 kontaminantu z DL1 kultury opakovaným restreaking izolovaných kolonií pěstovaných na zpevnil acetát-fumarát médium (7), ale KN400 kmen i nadále přetrvávat na nízké frekvenci v izolovaných koloniích (Tabulka 1)., Nicméně, kulturu, v níž KN400 již nemohla být zjištěna byla získána v kapalném acetát-fumarát střední (viz Text S1 na doplňkový materiál), v němž nejvyšší ředění vykazující růst byl podroben několika po sobě jdoucích kolech sériové ředění (Tabulka 1). To prokázalo, že kmen DL1 nevyžaduje vzácnou přítomnost KN400, aby rostl v acetát-fumarátovém médiu, na kterém je tato kultura běžně udržována.
Když byly čisté KN400 a DL1 kultura bez KN400 naočkovány do octan-fumarátového média ve stejném množství, DL1 outcompeted KN400 (obr., 1a). To je v souladu se zjištěním, že když dva kmeny byly pěstovány odděleně, DL1 rostla mnohem rychleji, než KN400 (optická hustota při 600 nm 0,04 pro KN400 versus 0.65 pro DL1 po 36 hodinách inkubace; viz Obr. S2 v doplňkovém materiálu) ve stejném médiu. Podíl KN400 pokračoval v poklesu s po sobě jdoucími převody (1% inokulum), dokud nebylo množství KN400 srovnatelné s množstvím v PCA a DL1 zásobních kulturách (Viz Text S1 v doplňkovém materiálu). KN400 přetrvával na této nízké úrovni s dalšími převody (obr. 1a).,
obrázek S2
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Toto je open-access článek distribuovaný pod podmínkami Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported license, což umožňuje neomezený nekomerční použití, šíření a reprodukce v libovolném médiu, za předpokladu, že původní autor a zdroj jsou připsány.,
Růst a aktivitu kmen KN400 za různých růstových podmínek. (a) Relativní hojnost KN400 v po sobě jdoucích mid-log převody (1% inokula) kultury zahájena stejném poměru KN400 a DL1. Výsledkem jsou prostředky a standardní odchylky trojitých kultur. (b) Stávající produkce, kdy DL1 kultury byl zaveden do anodové komory bioelectrochemical systém s grafit anody chystá na -400 mV vs. Ag/AgCl. Kultura bez KN400 během této doby nevytvořila žádný proud., c) Relativní hojnost KN400 v anodových biofilmech, kdy počáteční inokulum bylo DL1 kultura následně zjištěno, že také obsahují KN400. Výsledkem jsou prostředky a standardní odchylky trojitých kultur.
Opakované pokusy o růst KN400-zdarma DL1 kultury na anodové chystá na -400 mV byly neúspěšné. Proud byl však snadno produkován v jiné sadě experimentů, ve kterých kultura DL1 obsahující KN400 sloužila jako inokulum (obr. 1b)., QPCR test DNA extrahované z anodového biofilmu ukázal, že 100% sekvencí omcS bylo KN400 během druhého přenosu (obr. 1c). Tyto výsledky naznačovaly, že důvodem, proč se KN400 objevil na anodách, bylo to, že kmen DL1 nebyl schopen růst za uložených podmínek. Bez této neobvyklé selektivní tlak, KN400 by zůstaly neodhaleny v PCA a DL1 kultury i v současné době k dispozici příští generace sekvenování metody, které mohou teoreticky thousandsfold pokrytí v sekvenování genomu.,
faktory přispívající k dlouhodobému přetrvávání kmene KN400 při extrémně nízké frekvenci v kultuře DL1 zůstávají záhadou. Význam fyzicky izolovat jednotlivé buňky pomocí metody více určující než pruhování na pevné médium pro stanovení čistých kultur byla uznána za nějaký čas (17), a stále více sofistikované metody, jak toho dosáhnout, i nadále rozvíjet (18-23)., Nejběžnější však zůstávají metody pokovování, které se používají více než 100 let a jsou vyučovány každému studentovi mikrobiologie jako standardní postupy pro získání čistých kultur (4-6). Výsledky zde prezentované ukazují, že bez jednobuněčné izolace, záhadné kontaminujících látek může přežít na velmi nízké frekvenci v kulturách po desetiletích intenzivního vyšetřování a může uniknout detekci, dokonce nejvíce sofistikované metody sekvenování v současné době k dispozici.,
Obrázek S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Toto je open-access článek distribuovaný pod podmínkami Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported license, což umožňuje neomezený nekomerční použití, šíření a reprodukce v libovolném médiu, za předpokladu, že původní autor a zdroj jsou připsány.,