3.1.2.2. HPLC
pomocí HPLC acetonitril – nebo hexan-založené mobilní fáze umožňuje přímou detekci fosfolipidů bez předchozího čištění surového extraktu, čímž tyto metody jednoduché a rychlé. Tyto metody však účinně neoddělují různé fosfolipidy inositolu. Nakamura et al. (1989) vyvinuli postup HPLC, který specificky analyzuje Ptdiny a PtdInsP2 v mozku., V této metodě, extrakt lipidů je první derivatizován s 9-anthryldiazomethane vyrábět (9-anthryl) PtdInsP a di(9-anthryl) PtdInsP2 a pak derivatizovaný vzorek je oddělen pomocí HPLC s UV detekcí při 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn a SM nejsou derivatizovány tímto činidlem, a proto nezasahují do testu (Yamada et al., 1988). Tato metoda je citlivější než metoda detekce podivatizovaného UV záření pro analýzu inositolových fosfolipidů.
Low (1990) popsal použití deae celulózových sloupců pro preparativní HPLC mozkových lipidů., Fosfolipidy mozku rozpuštěné v 50 ml rozpouštědla a (chloroform / methanol / H2O, 20:9: 1, obj.) a aplikuje se na celulózový sloupec (deae celulóza, Sigma), který se promyje alkalickými látkami a kyselinou na neutralitu. Umyté DEAE celulosa je balena do skleněné kolony (2 cm × 38 cm) s rozpouštědlem odolné kování. Sloupec je pak eluovány při průtoku 100 ml/h s 1 1 lineární gradient z 100% Rozpouštědel A až 100% Rozpouštědlem B (Rozpouštědlo obsahující 0,6 M octan amonný) a 13-15 ml frakce jsou sbírány a testovány pro fosfor (Obr. 3.3).,
Obr. 3.3. Izolace Ptdinsp z mozku skotu pomocí chromatografie kolony deae-celulózy. Kyselina prát methanol-vysráží Folch Frakce byla eluována z DEAE-celulosa sloupec s gradientem 100% Rozpouštědle (chloroform/mefhanol/H2O, 20:9:1, obj.) do 100% rozpouštědla B (rozpouštědlo a obsahující 0,6 m octanu amonného) a 13-15 ml odebraných frakcí. Frakce byly testovány na organický fosfor. Průměrné využití aplikovaného organického fosforu bylo přibližně 90%., Vrchol elutuje v počtu zlomků. Dvacet pět bylo reprodukovatelně přítomno, ale nebylo identifikováno. Složení vrcholů bylo určeno TLC analýzou sdružených frakcí. Vrcholy jsou identifikovány tak, jak je znázorněno na obrázku.
reprodukováno Od Low (1990) se svolením vydavatele.
alternativně, Low (1990) provedl chromatografický krok preparativním HPLC pomocí aminoskupiny. Mozkové fosfolipidy byly rozpuštěny v 5 ml rozpouštědla a a byly aplikovány s průtokem 2.,5 ml/min 10 mm × 250 mm amino-NP kolona (5 µm sférický silikagel s n-propylamine vázané fáze, IBM Nástroje, Danbury, CT) s 4.5 mm × 50 mm předkolona vyrovnávají s Rozpouštědlem A sloupci je eluovány při průtoku 2,5 ml/min s 25 ml Rozpouštědla A, 125 ml gradient 100% Rozpouštědel A až 100% Rozpouštědlem B, a 100 ml 100% Rozpouštědlem B; 5 ml frakce byly shromažďovány. Sdružené frakce se koncentrují úpravou na 18 ml rozpouštědlem a a extrahovanými fosfolipidy. Průměrné zotavení organického fosforu je 80%., Bylo dosaženo úplného oddělení Ptdinů (90 ml), PtdInsP (150 ml) a PtdInsP2 (160-200 ml) (chromatogram není zobrazen). Ptdiny se však překrývají s PtdSer. Složení vrcholů bylo určeno TLC sdružených frakcí.
Low (1990) také popsal čištění Ptdinů označených HPLC(4)P a Ptdinů(4,5)P2 z lidských krevních destiček. Lipidový extrakt z krevních destiček byl připraven z 60 ml čerstvé lidské krve v přítomnosti methanolu vysráženého Ptdinsp mozku jako nosiče, je nakonec znovu vyřešen v 0.,5 1 Rozpouštědlem a aplikovat při průtoku 1 ml/min 4,5 mm × 250 mm amino-NP sloupec rovnovážného stavu v Rozpouštědle A. sloupci je eluovány s 5 ml Rozpouštědla (25 ml lineární gradient z 100% Rozpouštědel A až 100% Rozpouštědlem B) a 20 ml Rozpouštědla B. Jeden mililitr zlomky jsou shromažďovány a radioaktivity stanovena pomocí kapalinové scintilační spektrometrie. Průměrné využití aplikované radioaktivity je přibližně 70%. Existuje vynikající rozlišení tří inositol fosfatidů, ale Ptdiny se překrývají s PtdOH., Proto tento postup HPLC není vhodný pro přípravu Ptdinů, protože PtdOH, který je ve většině typů buněk rychleji označen Pi, není z něj vyřešen. Je pravděpodobné, že jiné aniontové fosfolipidy, jako je PtdSer, budou špatně vyřešeny z Ptdinů sloupcem amino-NP, jak je pozorováno při postupu deae-celulóza.
jak bylo uvedeno výše, žádná z výše uvedených metod není účinná při oddělování jednotlivých Ptdinsp v čisté formě od surových tkáňových extraktů. Proto musí být lipidové extrakty zpracovány několika chromatografickými kroky., Za tímto účelem je extrakt nejprve podroben Sephadex chromatografii pro oddělení lipidů od neklipidů v extraktu. Lipidová frakce se pak nalije na sloupec DEAE, který je eluován různými rozpouštědly. Ptdinsp se získávají elucí chloroform/methanol / amonná sůl jako konečný eluční krok. Jednotlivé frakce se koncentrují na 100 µl při 45°C pod dusíkem a poté se koncentrovaný zbytek dále oddělí chromatografií, TLC, HPLC nebo jinými chromatografickými postupy.,
Singh (1992) popsal extrakce a analýza PtdIns, PtdIns(4)P a PtdIns(4,5)P2 pomocí Sep-Pak kazetu. Celkový lipidový extrakt (Folch et al., 1957) z mozku potkana synaptozomů a mikrocév byl nejprve připraven a první frakce získané (Frakce 1) byly shromážděny a dále extrahovány do samostatných fosfolipidy a glykolipidy, jak je popsáno v Dugan et al. (1986). Fosfolipidové frakce byla podrobena DEAE-celulózové chromatografie (separace sekvence 4) jak je popsáno v Rouser et al. (1969) k dalšímu čištění inositolových lipidů., Vyčištěný extrakt byl převeden do zásobní vložky Sep-Pak. Různé inositol lipidy jsou eluovány z kolony s lineárním gradientem octanu amonného a vody od 0,5% octanu amonného (200 mM) a 99,5% vody na 75% octanu amonného a 25% vody za 60 min při průtoku 0,5 ml/min (viz Kapitola 2). Sloupec eluát po dobu 120 minut byl shromážděn v 1 ml frakcích. Různé vrcholy byly identifikovány pomocí ptdinů, Ptdinů(4)P a Ptdinů(4,5)P2 jako referenčních bodů., Frakce obsahující jednotlivé inositolové lipidy byly sloučeny a analyzovány HPLC, jak je popsáno Geurts van Kessel et al. (1977). Jednotlivé fosfolipidy byly detekovány při 206 nm pomocí detektoru diodového pole naprogramovaného pro skenování rozsahu 200-350 nm. Singh (1992) prokázal 50-90% zotavení Ptdinů a InsPs ze vzorků mozku. InsP3 a InsP4 vykazovaly nejnižší zotavení kvůli špatné kvantifikaci spíše než špatné metodě extrakce. Metody kazet nebyly použity pro izolaci Ptdinů (3)P, Ptdinů(3,4)P2 a Ptdinů (3,4,5) P3.
cronholm et al., (1992) popsali izolaci Ptdinsp z krysího pankreatu. Každý slinivky břišní byl okamžitě homogenizuje ve 3 ml chloroform/methanol (1:2, v/v), a o 3 MBq 3H-označené PtdIns(4)P nebo PtdIns(4,5)P2 byly přidány spolu s 0.6 ml 1.2 aq. HCl před extrakcí chloroforem, jak je popsáno Schachtem (1981). Methanol byl přidán do sdružených a promytých extraktů, aby se získal chloroform / methanol (3: 2, v/v). Roztok byl aplikován na Lipidex-sloupci DEAE, a většina lipidů byly eluovány s chloroform/methanol (3:2, v/v) nebo chloroform/methanol/voda (3:6:1 obj.)., Ptdiny a PtdSer byly eluovány společně s 0,03 M H3PO4 a neidentifikovaným materiálem s 0,1 M H3PO4. PtdIns(4)P byla eluována s 0,25 M H3PO4 a PtdIns(4,5)P2 s 0,5 M H3PO4 jak je uvedeno eluovány radioaktivity. Všechny frakce byly extrahovány 0, 4 ml vody/ml eluátu. Horní fáze byla zpětně extrahována 0,1 vol. chloroformu. Sdružené chloroformní fáze byly promyty 0,4 obj. 0,5 M HCl v 50% aq. methanol. Frakce byly použity pro stanovení molekulárních druhů FAB / MS (viz níže).
Gunnarsson et al., (1997) používá normální fáze HPLC s odpařovací světlo rozptyl detekce pro analýzu komerčních vzorků Ptdinsp spolu s dalšími fosfolipidy. Použití lineárního gradientu a, chloroform / methanol / amoniak (50:45:3, obj.) a B, chloroform / methanol / voda / amoniak (25:55: 17: 3, obj.) jsou získány dobře vyřešené pozdní vznikající vrcholy pro Ptdiny(4)P a Ptdiny (4,5)P2. Křivky odezvy dávky pro Ptdiny (4)P a Ptdiny(4,5) P2 nebyly lineární, což je charakteristika detektoru rozptylu světla (výsledky nejsou zobrazeny)., Pro většinu účelů je technika HPLC vynikající v rozlišení, rychlosti a celkovém pohodlí postupu DEAE-celulózy a je metodou volby, pokud je k dispozici zařízení HPLC. Deae-celulóza je levná a čištění ve velkém měřítku může vyžadovat použití tohoto materiálu. HPLC postup je také vynikající na některých nebo ve všech ohledech alternativní postupy pro čištění polyphosphoinositides, např. preparativní TLC nebo neomycin afinitní chromatografie.