Úvod
Ambra, známý přírodní produkt, velryba spermie , je také k dispozici jako náklad na plážích po celém světě , a byl velmi ceněný pro své užitné v průmyslu parfému . I když to dlouho bylo konstatováno, že jetsam ambra shromážděné na plážích pochází z velryby spermie , málo nebo žádné důkazy pro to, nebyl nikdy vydán, a rozdíly existují mezi těmito vzorky a vzorky ambra přímo převzaty z velryby spermie., Například, jetsam, ambra vzorky obvykle obsahují mnohem vyšší proporce triterpenoidních alkohol ambrein a mnohem nižší podíl sterolů než vzorky ambra z velryby spermie . Naopak ačkoli, Jetsam ambergris někdy obsahuje fragmenty chobotnice zobáky, a protože hlavonožci, jako je chobotnice, představují hlavní dietní složku spermií, toto bylo citováno jako důkaz původu Jetsam koprolitů z velryb spermií. To je dokonce teoretizoval ambergris může pocházet jako patologický sekrece z dráždivé tvrdé chobotnice zobáku chitin ., Nicméně, jiných mořských savců (např. členové Globicephala a Ziphiidae) také loví chobotnice , a někteří (včetně trpasličí a trpasličí velryby spermie) jsou také uváděn jako potenciální zdroje ambry . Proto, aby se ozřejmil původ jetsam ambra, jsme analyzovali DNA z ambry vzorku odebraného z vorvaně na pláži v Nizozemsku a ve srovnání s DNA izolované z jetsam ambra odebraného z pláže na Novém Zélandu a na Srí Lance.,
Ambergris se považuje za převážně složený z ambreinu kvůli jeho produkci z skvalenu, společného metabolického produktu v mnoha organismech . Tento proces může být vyvolán střevním mikrobiálním vlivem a vysráží se v hustých, pevných hmotách uvnitř tlustého střeva velryby . Na coprolitic narůstání, že výsledkem jsou skladebně dobře-vhodný k zachování DNA z tlustého střeva od ambrein je hydrofobní a zdá se odolný vůči degradaci v kyselém střevním prostředí., Důkazy z radiokarbonové datování jistě označuje odolnost proti mikrobiální a foto-degradace mořského prostředí až tisíciletí v některých jetsam ambra vzorků . Předpokládali jsme, že takový materiál by mohl poskytnout vhodnou mezipaměť pro zachování DNA, a to i po dlouhodobém vystavení škodlivým podmínkám na moři.
Materiál a metody
Jetsam ambra exemplářů ze Severního Moře, Indického Oceánu a Pacifiku byly analyzovány, což představuje materiál je globální distribuci ., Tři vzorky Jetsam ambergris (jeden ze Srí Lanky, dva z Pitt Island, Nový Zéland) byly převzorkovány pro extrakci DNA. Čtvrtý exemplář pocházel z pitvy samčí velryby spermie v prosinci 2012 v Razende Bol poblíž Texelu v Nizozemsku. Druhá „čerstvá“ ambergris z potvrzeného jatečně upraveného těla velryby spermie poskytla známé srovnání se vzorky jetsam s nepotvrzenou biologickou historií. Vzorky ambrézy byly získány a analyzovány na obsah ambreinu a fekálního sterolu v předchozích studiích .,
extrakce a sekvenování DNA byly provedeny na GLOBE Institute, University of Copenhagen, ve specializované starověké dna laboratoři po přísných postupech pro minimalizaci kontaminace. Přibližně 120 mg bylo převzorkováno (obrázek 1 a tabulka 1) pro extrakci DNA. Vzorky byly inkubovány v pufru obsahujícím 400 µl proteinázy k po Gilbert et al. při teplotě 56°C po dobu 10 h; supernatanty byly poté ošetřeny pomocí fenol–chloroformního kroku po Carøe et al., a čištěny pomocí Monarch dna Cleanup Columns (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) podle pokynů výrobce. Dvouvláknové knihovny byly postaveny z extraktů DNA podle nejlepšího protokolu, navržené a osvědčené speciálně pro sekvenování starověké a degradované DNA. Knihovny byly zesíleny a indexovány pomocí PCR pomocí Pfuturbo CX Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) podle pokynů výrobce., Výrobky byly sloučeny v ekvimolární koncentraci, než sekvenování na Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA) platformu, pomocí 80 bp single end číst chemie na dánské Národní High-throughput Sekvenování DNA Centrum, Kodaň, Dánsko.
Obrázek 1. Podrobnosti o analyzovaných vzorcích Ambra. (a) mapa ukazující lokality, kde byly původně nalezeny vzorky ambergris., (b) Fotografie ukazuje vysokou rozmanitost ve fyzické vlastnosti ambra fragmenty: TEXEL151212 (z členitý velryba exemplář) byl zrnité konzistenci, zatímco jetsam vzorky povrchně objevil se více hustý a heterogenní, a jsou vnitřně equigranular a výrazně světlejší barvu.
| ukázka | umístění | celková hmotnost (g) | analyzovány hmotnostní (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| . S. 01 | Pitt Island, Nový Zéland | 50 | 96 | 92 |
| . S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| . S.,03 | západní Srí Lance | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Nizozemsko | 83000 | 92 | 93 |
| ukázka | celkem nerozdělený čte | průměrná udržel číst délka (bp) | celkem vyrovnané čte (mtDNA) | krát pokrytí (mtDNA) | celkem vyrovnané čte (celý genom) | krát pokrytí (celý genom) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| . S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| . S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| . S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
analýza Sekvencí byla provedena na high-performance computing facility na Univerzitě v Kodani, s FASTQ souborů zpracovaných pomocí PALEOMIX potrubí (v. 1.2.13) . FastQC v. 0.11.8 byl původně použit pro kontrolu kvality surových sekvenčních dat. Adaptéry byly oříznuty pomocí Adaptéruodstranění v. 2.3.1, s odečty méně než 25 bp také odstraněny. Čtení bylo pak mapováno na referenční sekvence pomocí BWA, také použití mapDamage2.,0 pro základní kvantifikaci degradace, produkující zarovnání s referenčními sekvencemi. ANGSD byl pak použit k výrobě sekvencí ve formátu FASTA.
Nejistota ohledně původu a biologické mechanismy pro produkci ambry nás přiměla uvažovat více možných kandidát kytovců a pinniped druhů v sekvenční analýze. Druhy identity bylo usuzováno mapování úspěch a fylogenetický vztah k 19 kytovců a pinniped kandidáta druhů v NCBI RefSeq (viz elektronický doplňkový materiál)., Tyto druhy byly vybrány na základě potenciální vhodnost jako hluboce-potápění mořských savců plnící podobné ekologické niky na velryby spermie, vyloučit takové druhy, které jsou spolu přizpůsoben k produkci ambry. Vzorové sekvence byly zřetězeny a zarovnány pomocí MAFFT v. 7.392 . Fylogenetický strom modely pak byly vyráběny v MEGA X pomocí maximální-pravděpodobnost, že metoda s Hasegawa–Kishino–Yano model , se vzdálenosti odhadují maximální kompozitní pravděpodobnost přístupu (podrobnosti o všech referenční sekvence použity, jsou zahrnuty v elektronickém doplňkový materiál).,
výsledky
fylogenetické analýzy jednoznačně podpořily původ spermatu ze čtyř vzorků ambergris (obrázek 2; elektronický doplňkový materiál, obrázek S1). Podobně, sbližování s Physeter macrocephalus mitochondriální referenční genom z NCBI (NC_002503.2) produkoval nejvyšší pokrytí výsledky pro všechny vzorky ze všech zarovnání vyrobeny a poskytuje jistý přiznání, i když se značnými rozdíly v úspěšnosti mezi jednotlivými vzorky. Sekvenování vzorku z pletl velryby spermie (TEXEL151212) produkoval zdaleka nejvyšší pokrytí (cca., 20×) pro mitochondrion velryby spermie, zatímco jeden ze vzorků jetsam z Ostrova Pitt (s. 01) přinesl pouze přibližně 0, 2× pokrytí (viz tabulka 2). Zarovnání s Kogia sima (trpaslík, velryba spermie) a Kogia breviceps (pygmy sperm whale) referenční mitochondriálních genomů (NC_041303.1, NC_005272.1) také přineslo pokrytí (údaje v elektronické doplňkový materiál), ačkoli mnoho vysoce zachovaných funkčních regionů, které jsou sdíleny mezi analyzovaných druhů, což má za následek vysokou sekvenční podobnost . Nicméně, pokrytí pro druhy kogiid bylo obvykle kolem faktoru 10 méně než pro Physeter., Sladění s celým jaderným referenčním genomem P. macrocephalus (ASM283717v2) bylo také úspěšné, i když je to patrnější v porovnání celkového počtu čtení mapovaných na genom. Alignment for Architeuthis dux (obří chobotnice ), údajná běžná kořist velryb spermií (např.), byla neúspěšná, ale to není jejich převládající kořist .
Obrázek 2. Model fylogenetického stromu s maximální pravděpodobností generovaný z referenčních sekvencí a zarovnaných vzorků mitochondriálních genomů., Vzorky jsou jasně umístěny jako seskupení s velrybou spermie (P.macrocephalus) spíše než trpasličí a pygmy spermie velryby (Kogia spp.). Tento strom odráží nejvyšší log-pravděpodobnosti modelu, hodnoty odrážejí procento stromů počítačová, ve kterém spojené taxony byly clustery, což ukazuje důvěru v pozici, a větev délky měřit počet substitucí na každém místě (viz stupnice). Obrázek vyrobený v MEGA X . Zobrazení velryb z: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.televizor., Fylogenetický strom včetně všech 19 kandidátských druhů je prezentován v elektronickém doplňkovém materiálu, obrázek S1.
Výsledky z MapDamage ukázat pozoruhodně málo inter-vzorku ovlivňují rozdíly v C T přechody na 5′ pramen končí, i když vyšší procento G na přechody na 3′ konci existuje pro S. 01 (údaje v elektronické doplňkový materiál, obrázek S2), což naznačuje možnou vyšší biomolekulární degradace., Obecně však došlo k velmi malé chemické modifikaci a rozložení změn napříč prameny zůstává jednotné a ploché.
diskuse
tato studie prokázala, že tři vzorky Jetsam ambergris lze s jistotou připsat velrybě spermatu extrakcí DNA. Při potvrzení vorvaně původu jetsam ambra není překvapivý výsledek, tato studie je první v poskytování významné proof-of-concept v načítání endogenní DNA z ambry a úspěšně používat pro organismus identifikace., Důležité je, že původ všech tří jetsam ambra vzorky studoval zde lze s jistotou identifikovat jako velryba spermie, a to na základě nejen genetické zarovnání úspěch, ale také modelování mitochondriálních genomů na fylogenetické příbuznosti stromů, včetně pro velký vzorek outgroup mořských savců taxonů., Přestože všechny zde analyzované vzorky byly identifikovány jako pocházející z velryby spermie, je stále docela možné, že další úzce související mořští savci s hlubokým potápěním (jako jsou trpasličí a pygmy spermie) mohou produkovat ambergris a dosud nebyly zaznamenány.
převládající příčina dramatické změny genetického pokrytí pozorované mezi vzorky je nejasná. Analýza degradace DNA v mapDamage2.,0 vykazuje nízkou korelaci s zarovnání reportáže, jak by se dalo očekávat, a tam je také malé rozdíly mezi ambrein obsahu ve vzorcích, které by podle očekávání měly přispět k diferenciální DNA uchování. Přesný věk současných vzorků jetsam není znám, ačkoli předchozí studie úspěšně radiokarbonové datovaly jiné vzorky ambergris . Nicméně, radiocarbon chodit s někým relativně nedávných vzorků je problematický kvůli dopadu emisí fosilních paliv , a data radiocarbon od zvýšení antropického uvolňování uhlíku jsou nespolehlivé., Produkovat konzistentní rychlost rozkladu G na přechody v spolehlivě i starší vzorky by v budoucnu mohly pomoci lépe pochopit diferenciální poškození DNA. Další možností pro budoucí výzkum by mohly být studie deamidace glutaminu a racemizace kyseliny asparagové z analýzy organických peptidů, které mohou být také přítomny v ambergris . Alternativně by však variace uvnitř vzorku v koncentraci DNA a ambreinu mohla stejně pravděpodobně představovat nízké pokrytí ve vzorku s.,01, zatímco novější expozice tkáni velryby spermií nepochybně představuje vysoké pokrytí ve vzorku velryby TEXEL151212.
preservational potenciál ambrein se vysráží DNA vztahuje nejen na endogenní velryba genetika, ale také metagenomic pokrytí velryby střevního mikrobiomu, a potenciálně také DNA jejich kořist. Například, DNA, může také zůstat v částečně nebo nestrávené chobotnice zobák nalézt v velryba spermie stolici , a ambry , které jsou dokonce domníval, patologickou příčinou ambra sekrece ., Pochopení prokaryotické složení mikrobiomu prostředí ambra, může dále objasnit původ ambra, zejména přeměna skvalenu na ambrein a proces, při kterém ambra zdá formulář ve vrstvách narůstání. Další analýzy endogenního vyhledávání DNA z Jetsam ambergris, včetně také DNA z velrybí střevní mikrobioty a kořisti, by přinesly výrazně větší pohled na ekologii, vývoj a metabolismus velryb.,
Závěr
Jetsam ambra již dlouho tajemný materiál, předmětem diskuse a analýzy, ve vědeckých publikacích od osmnáctého století . Tato studie je první z našich znalostí, která prostřednictvím analýzy DNA předložila konečné potvrzení biologického původu vzorků Jetsam ambergris jako velryby spermií. Kromě toho však tato studie stanoví potenciál ambergris jako nového zdroje genetických dat souvisejících s velrybami spermií se značnou dlouhověkostí v průběhu času., Větší objasnění zbývá dosáhnout studiem konzervačních podmínek DNA v ambreinu a diferenciálních účinků z více faktorů. Potenciální důsledky pro napomáhání našemu chápání minulé dynamiky populace velryb a jejich ekologicky přidružených taxonů však mohou být hluboké. Nejstarší známé ambra nalézt v Pleistocénu vklady funkce permineralized chobotnice zobáky, které obsahují aminokyseliny, endogenní, aby chobotnice, což autoři připisují preservational kapacity místní sedimentu ., I když je nepravděpodobné, že DNA bude zachována pro takový věk (1.75 Ma), tento nález může být také připsat účinnost ambry a ambrein jako preservational substráty. Hodně je stále neznámá o ekologii a adaptace mořských obrů dříve charakterizovat jako semi-mýtické bestie, a ambry nyní může dokázat malý, ale významný klíč k pochopení některé další aspekty.
etika
všechny vzorky byly získány a eticky analyzovány v této studii, která je součástí projektu DNRF-128 PROTEIOS., Ze čtyř ambra vzorky analyzovány v této studii, tři (S. 01. 03) byly subsampled z materiálu studovány. S. J. R. v předchozích publikacích (viz výše), získaná jako jetsam ambra našel na plážích (vzorek č. ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 a ACL237-S. 03). Čtvrtý vzorek (TEXEL151212) byla laskavě poskytnuta jako dílčí vzorek ambra exemplář TEXEL151212 Dr. A. Oosterbaan jménem EcoMare Muzeum, Texel, Nizozemsko, kde je zbytek tohoto vzorku je stále koná. Jsme vděční za povolení muzea použít tento vzorek.,
Přístupnost dat
příspěvky autorů
konkurenční zájmy
prohlašujeme, že nemáme žádné konkurenční zájmy.
financování
Financování bylo poskytnuto dánskou Národní výzkumnou nadací Grant PROTEIOS (DNRF128).
poděkování
R. M. je vděčný Dr. J. a. Samaniego za radu ohledně genomických analýz a také m.McCarthy za radu a diskuse. Jsme vděční Dr. A. Oosterbaanovi (Ecomare Museum, Texel) za vzorek s.04 a anonymním sběratelům vzorků s. 01–s. 03., Autoři by chtěli ocenit pomoc dánského národního centra pro sekvenování s vysokou propustností v Illumina data generation.
poznámky pod čarou
elektronický doplňkový materiál je k dispozici online na https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
vydané Královské Společnosti podle podmínek Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, který umožňuje neomezené použití, za předpokladu, že původní autor a zdroj jsou připsány.