země je domovem milionů bakteriálních druhů, z nichž každý má jedinečné vlastnosti. Identifikace těchto druhů je rozhodující při hodnocení vzorků prostředí. Lékaři také potřebují rozlišovat různé bakteriální druhy k diagnostice infikovaných pacientů.

pro identifikaci bakterií lze použít různé techniky, včetně mikroskopického pozorování morfologie nebo růstu na konkrétním médiu pro pozorování morfologie kolonií., Genetická analýza, další technika pro identifikaci bakterií rostla v popularitě v posledních letech, částečně kvůli sekvenování genů 16S ribozomální RNA.

bakteriální ribozom je proteinový RNA komplex sestávající ze dvou podjednotek. Podjednotka 30S, menší z těchto dvou podjednotek, obsahuje 16S rRNA, který je kódován genem 16S rRNA obsaženým v genomické DNA. Specifické oblasti 16S rRNA jsou vysoce konzervované díky své základní funkci v ribozomovém shromáždění. Zatímco jiné oblasti, méně kritické pro funkci, se mohou u bakteriálních druhů lišit., Variabilní regiony 16S rRNA, mohou sloužit jako jedinečné molekulární otisky prstů pro bakteriální druhy, což nám umožňuje rozlišovat fenotypově identické kmeny.

po získání kvalitního vzorku gDNA může začít PCR genu kódujícího rRNA 16S. PCR je běžně používaná v molekulární biologii metoda, skládající se z cyklů denaturace dvouvláknové DNA šablony, žíhání univerzální primer párů, které zesilují vysoce konzervované oblasti genu, a rozšíření primery pomocí DNA polymerázy., Zatímco některé primery zesilují většinu genu kódujícího rRNA 16S, jiné pouze zesilují jeho fragmenty. Po PCR mohou být produkty analyzovány pomocí elektroforézy agarózového gelu. Pokud byla amplifikace úspěšná, měl by gel obsahovat jedno pásmo očekávané velikosti, V závislosti na použitém páru primerů, až 1500bp, přibližnou délku genu 16S rRNA.

po očištění a sekvenování mohou být získané sekvence zadány do databáze výbuchu, kde je lze porovnat s referenčními sekvencemi 16S rRNA., Vzhledem k tomu, že tato databáze vrací zápasy založené na nejvyšší podobnosti, umožňuje to potvrzení totožnosti bakterií zájmu. V tomto videu, budete pozorovat 16S rRNA genové sekvenování, včetně PCR, dna sekvenční analýza a editace, sestava sekvence a vyhledávání databáze.

při manipulaci s mikroorganismy je nezbytné dodržovat správnou mikrobiologickou praxi, včetně použití aseptické techniky a nošení vhodných osobních ochranných prostředků. Po provedení vhodného posouzení rizika pro mikroorganismus nebo environmentální vzorek zájmu, získat zkušební kultury., V tomto příkladu se používá čistá kultura Bacillus subtilis.

Chcete-li začít, Pěstujte svůj mikroorganismus na vhodném médiu za vhodných podmínek. V tomto příkladu se Bacillus subtilis 168 pěstuje v lb vývaru přes noc v třepacím inkubátoru nastaveném na 200 ot / min při 37 stupních Celsia. Dále použijte komerčně dostupnou sadu k izolaci genomické DNA nebo gDNA z 1, 5 mililitrů kultury B.subtilis přes noc.

Chcete-li zkontrolovat kvalitu izolované DNA, nejprve smíchejte pět mikrolitrů izolované gDNA s jedním mikrolitrem dna gelového barviva. Potom vložte vzorek na 0.,8% agarózový gel obsahující činidlo pro barvení DNA, jako je SYBR safe nebo EtBr. Poté vložte do gelu jeden kilobázový molekulární hmotnostní standard a elektroforézu spusťte, dokud přední barvivo není přibližně 0,5 centimetrů od dna gelu. Jakmile je gelová elektroforéza dokončena, vizualizujte gel na transiluminátoru modrého světla. GDNA by se měla objevit jako tlustý pás, který má velikost nad 10 kilobáz a má minimální rozmazání.

poté vytvořte sériová ředění gDNA, označte tři mikrocentrifuge zkumavky jako 10x, 100x a 1000x., Poté použijte pipetu k dávkování 90 mikrolitrů sterilní destilované vody do každé zkumavky. Dále přidejte 10 mikrolitrů roztoku gDNA do zkumavky 10X. Pipetujte celý objem nahoru a dolů, aby se zajistilo, že se roztok důkladně promíchá. Poté vyjměte 10 mikrolitrů roztoku z trubice 10X a přeneste jej do zkumavky 100X. Smíchejte roztok, jak bylo popsáno výše. Nakonec přeneste 10 mikrolitrů roztoku do zkumavky 100X do zkumavky 1000x.

Chcete-li zahájit protokol PCR, rozmrazte potřebná činidla na ledu. Poté připravte PCR master mix., Vzhledem k tomu, že DNA polymeráza je aktivní při pokojové teplotě, musí se nastavit reakce na ledu. Alikvot 49 mikrolitrů master se mísí do každé zkumavky PCR. Poté přidejte jeden mikrolitr šablony do každé experimentální zkumavky a jeden mikrolitr sterilní vody do negativní kontrolní trubice, pipetujte nahoru a dolů a promíchejte. Poté nastavte počítač PCR podle programu popsaného v tabulce. Vložte zkumavky do termocycleru a spusťte program.,

jakmile je program dokončen, zkontrolujte kvalitu vašeho produktu pomocí elektroforézy agarózového gelu, jak bylo dříve prokázáno. Úspěšná reakce pomocí popsaného protokolu by měla přinést jedno pásmo přibližně 1,5 kilobázy. V tomto příkladu vzorek obsahující 100x zředěnou gDNA přinesl produkt nejvyšší kvality. Dále vyčistěte nejlepší produkt PCR, v tomto případě 100x gDNA, s komerčně dostupnou sadou. Nyní může být produkt PCR odeslán pro sekvenování.

v tomto příkladu je produkt PCR sekvenován pomocí dopředných a zpětných primerů., Jsou tedy generovány dvě datové sady, z nichž každá obsahuje sekvenci DNA a chromatogram DNA: jedna pro přední primer a druhá pro reverzní primer. Nejprve zkontrolujte chromatogramy generované z každého primeru. Ideální chromatogram by měl mít rovnoměrně rozmístěné vrcholy s malými až žádnými signály na pozadí.

Pokud chromatogramy zobrazují dvojité vrcholy, mohlo být v produktech PCR přítomno více šablon DNA a sekvence by měla být zlikvidována. Pokud chromatogramy obsahovaly vrcholy různých barev na stejném místě, sekvenční software pravděpodobně nesprávně označil nukleotidy., Tuto chybu lze v textovém souboru ručně identifikovat a opravit. Přítomnost širokých vrcholů v chromatogramu naznačuje ztrátu rozlišení, což způsobuje nesprávné počítání nukleotidů v přidružených oblastech. Tato chyba je obtížné opravit a neshody v některém z následujících kroků by měly být považovány za nespolehlivé. Špatná kvalita čtení chromatogramu, indikovaná přítomností více vrcholů, se obvykle vyskytuje na pěti hlavních a třech hlavních koncích sekvence. Některé sekvenční programy automaticky odstraní tyto sekce nízké kvality., Pokud vaše sekvence nebyla automaticky zkrácena, identifikujte fragmenty nízké kvality a odstraňte jejich příslušné základny z textového souboru.

pomocí programu sestavení DNA sestavte dvě sekvence primerů do jedné kontinuální sekvence. Nezapomeňte, že sekvence získané pomocí dopředných a zpětných primerů by se měly částečně překrývat. V programu sestavení DNA vložte dvě sekvence ve formátu FASTA do příslušného pole. Poté klikněte na tlačítko Odeslat a počkejte, až program vrátí výsledky.

Chcete-li zobrazit sestavenou sekvenci, klikněte na Contigs na kartě Výsledky., Poté, Chcete-li zobrazit podrobnosti o zarovnání, vyberte podrobnosti o sestavě. Přejděte na web pro základní nástroj pro vyhledávání místního zarovnání nebo výbuch a vyberte nástroj nucleotide BLAST, který porovná vaši sekvenci s databází. Zadejte svou sekvenci do textového pole sekvence dotazu a vyberte příslušnou databázi v nabídce přejděte dolů. Nakonec klikněte na tlačítko BLAST v dolní části stránky a počkejte, až nástroj vrátí nejpodobnější sekvence z databáze.

v tomto příkladu je horní hit B., subtilis strain 168, ukazující 100% identitu se sekvencí v databázi výbuchu. Pokud horní hit nezobrazuje 100% identitu vašeho očekávaného druhu nebo kmene, kliknutím na sekvenci, která nejvíce odpovídá vašemu dotazu, zobrazíte podrobnosti o zarovnání. Zarovnané nukleotidy budou spojeny krátkými svislými čarami a neshodné nukleotidy budou mít mezery mezi nimi. Zaměřte se na identifikované neodpovídající oblasti, revidujte sekvenci a v případě potřeby opakujte vyhledávání výbuchu.