Die Erde beherbergt Millionen von Bakterienarten mit jeweils einzigartigen Eigenschaften. Die Identifizierung dieser Arten ist entscheidend für die Bewertung von Umweltproben. Ärzte müssen auch verschiedene Bakterienarten unterscheiden, um infizierte Patienten zu diagnostizieren.
Zur Identifizierung von Bakterien können verschiedene Techniken angewendet werden, einschließlich der mikroskopischen Beobachtung der Morphologie oder des Wachstums auf einem bestimmten Medium zur Beobachtung der Koloniemorphologie., Genetische Analyse, eine andere Technik zur Identifizierung von Bakterien hat in den letzten Jahren an Popularität gewonnen, teilweise aufgrund der ribosomalen RNA-Gensequenzierung von 16S.
Das bakterielle Ribosom ist ein Protein-RNA-Komplex, der aus zwei Untereinheiten besteht. Die 30S-Untereinheit, die kleinere dieser beiden Untereinheiten, enthält 16S-rRNA, die durch das in der genomischen DNA enthaltene 16S-rRNA-Gen codiert wird. Spezifische Regionen der 16S-rRNA sind aufgrund ihrer essentiellen Funktion in der Ribosomenanordnung stark konserviert. Während andere Regionen, die für die Funktion weniger kritisch sind, zwischen den Bakterienarten variieren können., Die variablen Regionen in 16S rRNA können als einzigartige molekulare Fingerabdrücke für Bakterienarten dienen, so dass wir phänotypisch identische Stämme unterscheiden können.
Nach Erhalt einer Qualitätsprobe von gDNA kann die PCR des 16S-rRNA-kodierenden Gens beginnen. PCR ist eine häufig verwendete molekularbiologische Methode, die aus Zyklen der Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Schablone, dem Glühen universeller Primerpaare, die hochkonservierte Regionen des Gens amplifizieren, und der Erweiterung von Primern durch DNA-Polymerase besteht., Während einige Primer den größten Teil des 16S-rRNA-kodierenden Gens amplifizieren, amplifizieren andere nur Fragmente davon. Nach der PCR können die Produkte mittels Agarosegelelektrophorese analysiert werden. Wenn die Amplifikation erfolgreich war, sollte das Gel ein einzelnes Band einer erwarteten Größe enthalten, abhängig von dem verwendeten Primerpaar, bis zu 1500bp, der ungefähren Länge des 16S-rRNA-Gens.
Nach der Reinigung und Sequenzierung können die erhaltenen Sequenzen dann in die BLAST-Datenbank eingegeben werden, wo sie mit Referenz-16S-rRNA-Sequenzen verglichen werden können., Da diese Datenbank Übereinstimmungen basierend auf der höchsten Ähnlichkeit zurückgibt, kann die Identität der interessierenden Bakterien bestätigt werden. In diesem Video werden Sie 16S-rRNA-Gensequenzierung beobachten, einschließlich PCR, DNA-Sequenzanalyse und-bearbeitung, Sequenzmontage und Datenbanksuche.
Beim Umgang mit Mikroorganismen ist es wichtig, eine gute mikrobiologische Praxis zu befolgen, einschließlich der Verwendung aseptischer Techniken und des Tragens geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Nach Durchführung einer geeigneten Risikobewertung für den interessierenden Mikroorganismus oder die Umweltprobe eine Testkultur erhalten., In diesem Beispiel wird eine reine Kultur von Bacillus subtilis verwendet.
Wachsen Sie Ihren Mikroorganismus zunächst unter geeigneten Bedingungen auf einem geeigneten Medium an. In diesem Beispiel wird Bacillus subtilis 168 über Nacht in einer Brühe in einem Schüttelinkubator auf 200 U / min bei 37 Grad Celsius angebaut. Verwenden Sie als Nächstes ein handelsübliches Kit, um genomische DNA oder gDNA aus 1,5 Millilitern der B. subtilis-Dna-Kultur zu isolieren.
Um die Qualität der isolierten DNA zu überprüfen, mischen Sie zunächst fünf Mikroliter der isolierten gDNA mit einem Mikroliter DNA-Gel-Ladefarbstoff. Laden Sie dann die Probe auf eine 0.,8% Agarosegel, enthaltend DNA-Färbereagenz, wie SYBR safe oder EtBr. Laden Sie danach einen Ein-Kilobase-Molekularmasse-Standard auf das Gel und führen Sie die Elektrophorese durch, bis sich der vordere Farbstoff etwa 0, 5 cm vom Boden des Gels entfernt befindet. Sobald die Gelelektrophorese abgeschlossen ist, visualisieren Sie das Gel auf einem Blaulichttransilluminator. Die gDNA sollte als dickes Band erscheinen, über 10 Kilobasis groß und minimal verschmiert sein.
Um anschließend serielle Verdünnungen der gDNA zu erzeugen, beschriften Sie drei Mikrozentrifugenröhrchen als 10X, 100X und 1000X., Verwenden Sie dann eine Pipette, um 90 Mikroliter steriles destilliertes Wasser in jedes der Röhrchen abzugeben. Als nächstes 10 Mikroliter der gDNA-Lösung in die 10X-Röhre geben. Pipette das gesamte Volumen auf und ab, um sicherzustellen, dass die Lösung gründlich gemischt wird. Entfernen Sie dann 10 Mikroliter der Lösung aus dem 10X-Röhrchen und übertragen Sie diese auf das 100X-Röhrchen. Mischen Sie die Lösung wie zuvor beschrieben. Übertragen Sie schließlich 10 Mikroliter der Lösung in die 100X-Röhre in die 1000X-Röhre.
Um mit dem PCR-Protokoll zu beginnen, tauen Sie die erforderlichen Reagenzien auf Eis auf. Bereiten Sie dann den PCR Master Mix vor., Da die DNA-Polymerase bei Raumtemperatur aktiv ist, muss die Reaktion auf Eis erfolgen. Aliquot 49 Mikroliter des Masters mischen sich in jedes der PCR-Röhrchen. Fügen Sie dann einen Mikroliter Schablone zu jedem der Versuchsröhrchen und einen Mikroliter steriles Wasser zum Negativkontrollröhrchen hinzu und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Stellen Sie danach die PCR-Maschine gemäß dem in der Tabelle beschriebenen Programm ein. Legen Sie die Rohre in den Thermocycler und starten Sie das Programm.,
Sobald das Programm abgeschlossen ist, untersuchen Sie die Qualität Ihres Produkts über Agarosegelelektrophorese, wie zuvor gezeigt. Eine erfolgreiche Reaktion unter Verwendung des beschriebenen Protokolls sollte ein einzelnes Band von etwa 1,5 Kilobase ergeben. In diesem Beispiel ergab die Probe, die 100X verdünnte gDNA enthielt, das Produkt von höchster Qualität. Reinigen Sie als Nächstes das beste PCR-Produkt, in diesem Fall den 100X gDNA, mit einem im Handel erhältlichen Kit. Jetzt kann das PCR-Produkt zur Sequenzierung gesendet werden.
In diesem Beispiel wird das PCR-Produkt mit Vorwärts-und Rückwärts-Primern sequenziert., Somit werden zwei Datensätze erzeugt, die jeweils eine DNA-Sequenz und ein DNA-Chromatogramm enthalten: einer für den Forward-Primer und der andere für den Reverse-Primer. Untersuchen Sie zunächst die Chromatogramme, die von jedem Primer erzeugt werden. Ein ideales Chromatogramm sollte gleichmäßig verteilte Peaks mit wenig bis gar keinen Hintergrundsignalen haben.
Wenn die Chromatogramme doppelte Peaks anzeigen, sind möglicherweise mehrere DNA-Vorlagen in den PCR-Produkten vorhanden, und die Sequenz sollte verworfen werden. Wenn die Chromatogramme Peaks unterschiedlicher Farben an derselben Stelle enthielten, hat die Sequenzierungssoftware wahrscheinlich Nukleotide falsch installiert., Dieser Fehler kann manuell identifiziert und in der Textdatei korrigiert werden. Das Vorhandensein breiter Peaks im Chromatogramm weist auf einen Auflösungsverlust hin, der zu einer Fehlzählung der Nukleotide in den assoziierten Regionen führt. Dieser Fehler ist schwer zu korrigieren und Nichtübereinstimmungen in einem der nachfolgenden Schritte sollten als unzuverlässig behandelt werden. Eine schlechte Chromatogrammlesequalität, die durch das Vorhandensein mehrerer Peaks angezeigt wird, tritt normalerweise an den fünf Primzahlen und drei Primzahlen der Sequenz auf. Einige Sequenzierungsprogramme entfernen diese minderwertigen Abschnitte automatisch., Wenn Ihre Sequenz nicht automatisch abgeschnitten wurde, identifizieren Sie die Fragmente geringer Qualität und entfernen Sie ihre jeweiligen Basen aus der Textdatei.
Verwenden Sie ein DNA-Assemblierprogramm, um die beiden Primersequenzen zu einer kontinuierlichen Sequenz zusammenzusetzen. Denken Sie daran, Sequenzen, die mit Vorwärts-und Rückwärts-Primern erhalten werden, sollten sich teilweise überlappen. Fügen Sie im DNA-Assemblerprogramm die beiden Sequenzen im FASTA-Format in das entsprechende Feld ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Senden und warten Sie, bis das Programm die Ergebnisse zurückgegeben hat.
Um die zusammengestellte Sequenz anzuzeigen, klicken Sie auf Contigs in der Registerkarte Ergebnisse., Wählen Sie dann Assembly Details aus, um die Details der Ausrichtung anzuzeigen. Navigieren Sie zur Website für das grundlegende Suchwerkzeug für lokale Ausrichtung oder BLAST und wählen Sie das Nukleotid-BLAST-Tool aus, um Ihre Sequenz mit der Datenbank zu vergleichen. Geben Sie Ihre Sequenz in das Textfeld Abfragesequenz ein und wählen Sie im Menü Nach unten scrollen die entsprechende Datenbank aus. Klicken Sie abschließend unten auf der Seite auf die Schaltfläche BLAST und warten Sie, bis das Tool die ähnlichsten Sequenzen aus der Datenbank zurückgegeben hat.
In diesem Beispiel ist der oberste Treffer B., subtilis Stamm 168, zeigt 100% Identität mit der Sequenz in der BLAST-Datenbank. Wenn der obere Treffer keine 100% ige Identität für Ihre erwartete Spezies oder Sorte anzeigt, klicken Sie auf die Sequenz, die Ihrer Abfrage am ehesten entspricht, um die Details der Ausrichtung anzuzeigen. Ausgerichtete Nukleotide werden durch kurze vertikale Linien verbunden und nicht übereinstimmende Nukleotide haben Lücken zwischen ihnen. Konzentrieren Sie sich auf die identifizierten nicht übereinstimmenden Regionen, überarbeiten Sie die Sequenz und wiederholen Sie die BLAST-Suche, falls gewünscht.