Abbildung 1. Drei ausgewählte Standbilder aus einem Film von NICHT erschöpften Zellen zeigen deutlich, dass sich das Zentromer/Kinetochor-Signal (rot) im Laufe der Zeit in ein Punktpaar auflöst, was zeigt, dass Chromosomen syntelisch an Spindelmikrotubuli gebunden sind (grün). 4D Fluoreszenzmikroskopie Datensätze wurden alle 30 Sekunden mit 0 gesammelt.,5 mm z-Schritte, die das gesamte Zellvolumen mit einem 100°, 1,4 NA planapochromatischen Objektiv bei 25°C mit Andor ‚ s Revolution Spinnscheibe Konfokaleinheit und iXon EMCCD Kamera abdecken, beide angetrieben von Andor IQ Live-Cell Imaging Software.
Die mitotische Zellteilung beruht auf der Fähigkeit der Zellen, Schwesterchromatide richtig in sich bildende Zellen zu verteilen. Um die Funktion zuverlässig auszuführen, verwenden Zellen interne Bearbeitungsmechanismen, um ungenaue Chromosom – / Spindelfaseranhänge zu korrigieren., Gepaarte Kinetochoren werden normalerweise ausgerichtet, um Spindelfasern richtig zu befestigen und Chromatin zu trennen, jedoch führen fehlerhafte und falsch ausgerichtete Kinetochoren. Zellen enthalten spezielle Bearbeitungsmechanismen, um diese falsch ausgerichteten Kinetochorpaare zu verhindern und zu korrigieren, obwohl der genaue Mechanismus hier nicht gut verstanden wird ., Es wird von Tatiana Moutinho-Santos an der Universidade do Porto, Portugals Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC), postuliert, dass das Vorhandensein einer Polokinase notwendig ist, um die Biorientierung der Chromosomen zu fördern (amphitelische Anordnung genannt) und dadurch die richtige Kinetochore-Ausrichtung zu erhalten.
Um seine Rolle bei der Regulierung der Kinetochorentwicklung besser zu verstehen, untersuchte Dr. Moutinho dos Santos die erschöpfte Drosophila-POLO-Kinase in lebenden Zellen, um Polos Beteiligung an den Bearbeitungsfunktionen zu belegen, die zur Aufrechterhaltung der amphitelischen Kinetochoranordnung erforderlich sind., In diesem Fall wurde die syntelische Anordnung (Schwesterkinetochoren, die an Mikrotubuli befestigt sind, die von derselben Spindel ausgehen) untersucht. Die Timelapse-Analyse der Mitose wurde an Drosophila S2-Zellen durchgeführt, die CID-mCherry stabil exprimierten, um die Zentromer zu visualisieren, und GFP-a-Tubulin für die Mikrotubuli. Die Visualisierung von Kinetochoren ist aufgrund ihrer geringen Größe, ihres geringen Fluoreszenzsignals und ihres kurzen Aussehens während der Zellteilung anspruchsvoll. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie wird oft verwendet, um Kinetochoren abzubilden, aber selbst in dieser Umgebung bleibt die Visualisierung schwierig., Die Kinetochoren sind sehr klein (300 nm)3, nahe an den lateralen Auflösungsfähigkeiten des Lichtmikroskops und übertreffen die axiale Auflösungsfähigkeit des Mikroskops. Darüber hinaus stellt die Abbildung fluoreszierender Marker in lebenden Zellen potenzielle phototoxische und Photobleaching-Effekte dar. Intensive Laserbeleuchtung kann zu Phototoxizitätsproblemen führen, die insbesondere für lebende, sich teilende Zellen schädlich sind.
Andor ‚ s Revolution XD Spinnscheibe konfokale Mikroskopie wird eingesetzt, um Dr. Moutinho dos Santos einzigartige Herausforderung im Zusammenhang mit der Beobachtung von Kinetochoren zu überwinden., In diesem Fall müssen vier verschiedene Faktoren gleichzeitig adressiert werden, um die dynamischen zellulären Prozesse adäquat zu visualisieren:
- Erfassungsgeschwindigkeit
- Räumliche und zeitliche Auflösungsfähigkeit
- Die Fähigkeit, sehr niedrige Fluoreszenzintensitätsstufen zu erkennen
- Verwaltung des verfügbaren Fluoreszenzsignals
Diese Themen der räumlichen, zeitlichen und Intensitätsauflösung treten häufig mit der Fluoreszenzmikroskopie auf und stehen häufig im Widerspruch zu Experimenten, die die Beobachtung der Zelllebensfähigkeit beinhalten., Beispielsweise erzeugen lange Kamerabelichtungen und längere Perioden mit hoher Intensität die phototoxischen Effekte, die lebende Zellen schädigen oder zerstören. Gleichzeitig erfordern leicht markierte Mikrostrukturen eine längere Sicht, können jedoch durch Photobleaching beeinträchtigt werden. Das Problem ist die Notwendigkeit, traditionelle dreidimensionale Daten mit denen der Zeit zu kombinieren. Schließlich bleibt es notwendig, das Signal von Hintergrundgeräuschen und unfokussiertem Dunst zu unterscheiden.
Die Geschwindigkeit der Akquisition ist für Dr. Mountinho dos Santos von besonderer Bedeutung., Kontrollzellen S2 weisen einen Teilungszyklus von etwa 30 Minuten auf. Die in ihren Experimenten verwendeten stark erschöpften S2-Zellen des POLOS zeigten jedoch eine Wartezeit von mehr als acht Stunden. Die Aufzeichnung der stark erschöpften Zellteilung erfordert eine Sammlung von 7.200 bis 12.000 Bildsätzen (zwei Fluorochrome, die alle dreißig Sekunden für ein bis fünf Stunden abgebildet werden und bei 0,5 Mikrometer Axialschritten mit bis zu 20 Schritten für eine axiale Kinetochore-Auflösung aufgenommen werden)., Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie und Laserbeleuchtung erlauben weder die notwendigen schonenden Beleuchtungsanforderungen noch die Schnelligkeit der Erfassung, um diese zeitempfindliche Aufgabe zu erfüllen. Zum Beispiel erfordert das Laserrastering in der traditionellen konfokalen Mikroskopie längere Zeiträume, um das Signal von der Probe zu sammeln. Konfokale Systeme mit Spinnscheiben werden verwendet, um diese traditionellen Barrieren zu überwinden und neue Erkenntnisse über molekulare Kinetochore-Bearbeitungstechniken zu gewinnen.,
Im Vergleich zu herkömmlichen Weitfeldfluoreszenzsystemen ist die räumliche Auflösung einer Spinnscheibe konfokal sowohl in lateralen (x und y) als auch in axialen (z) Dimensionen überlegen. Durch das ständige Scannen des Lochfelds können Proben in Echtzeit mit hohem Kontrast betrachtet werden, wodurch klare Bilder an den Beugungsgrenzen der Mikroskopopoptik bereitgestellt werden. Dies ermöglicht die 3D-Visualisierung und das Verständnis des dynamischen Kinetochorverhaltens in Bezug auf die Mikrotubuli der Spindel., Kinetochore-und Zentromer-laterale Auflösung von 300 nm und Spindelfaserauflösung von 300-500 nm wurden berichtet und sind in Abbildung A detailliert.
Intensitätsauflösung
Die Visualisierung der fluoreszenzmarkierten Kinetochoren, die jedem Zentromer zugeordnet sind, stellt zusätzliche Anforderungen an das Erfassungssystem. Die untersuchten Zentromer und Kinetochoren sind hauptsächlich nur während der Interphase der Zellteilung sichtbar. Während die Zellen die Prophase passieren, haben sich die Zentromer bereits zu Drosophilas typischen zwölf Chromosomenpaaren aufgelöst., Die Verwaltung des verfügbaren Lichtbudgets während einer langen Erfassung erfordert eine sanfte Beleuchtung und eine hohe Auflösung, die durch Spinnscheibentechniken erreicht werden kann. Die Öffnungen innerhalb der Drehscheibeneinheit bieten diese Vorteile. Da Licht Fluorophore nur dann anregt, wenn eine Öffnung vorhanden ist, werden phototoxische Effekte minimiert. Während es nicht intuitiv ist, zeigt ein reduziertes Lichtbudget keine schwachen, schwer zu erkennenden Objekte an. Die Intensitätsauflösung wird durch den Ausschluss des Unschärfesignals und die anschließende Signalverstärkung durch eine EMCCD-Kameraarchitektur der sich drehenden Scheibe erhöht., Dies schafft die neue Möglichkeit, kontrastreichere Bilder zu erzeugen, die die Entwicklung und Ausrichtung von punktierten Objekten wie Kinetochoren aufdecken.
Schlussfolgerungen
Der Einsatz der Spinnscheibe Technologie in Dr. Mountinho dos Santos Live cell Anwendung führte zu einer wichtigen Beobachtung. In Abwesenheit der Polokinase fehlten Drosophila-Zellen die Korrekturmechanismen, die zur Aufrechterhaltung der amphitelischen Chromosomenanordnung erforderlich waren., Die Anwesenheit des POLO wurde gezeigt, um die richtige Umgebung für die richtige zentromer-Architektur, während gleichzeitig eine angemessene Chromosom bi-Orientierung. Kultivierte Drosophila-Zellen, die in Abwesenheit von POLO-Kinase-Chromosomen einer Mitose unterzogen werden, heften sich an Spindelfasern mit syntelischer Orientierung, d. H. Mit Schwesterkinetochoren, die an Mikrotubuli befestigt sind, die von einem einzigen Spindelpol stammen.
Diese Schlussfolgerung wurde durch sorgfältige Analyse der 4D-Fluoreszenzmikroskopie in Zellen gezogen, die fluoreszenzmarkierte Zentromer – / Kinetochormarker und Mikrotubuli exprimieren. (Abbildung 1).